摘 要： 目的 研究异叶败酱Patrinia heterophylla Bunge的化学成分及其生物活性。方法 异叶败酱75%乙醇提取物采用大孔树脂、硅胶、中压液相、半制备高压液相进行分离纯化, 根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。CCK-8法检测各化合物抑制白血病细胞HL-60、K562活性。结果 从中分离得到7个化合物, 分别鉴定为patrinoside (1) 、roseosideⅡ (2) 、 (3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl- (1→6) -β-D-glucopyranoside (3) 、apigenin4′-O-β-D-glucopyranoside (4) 、fissoside B (5) 、芹菜素-7-O-β-D-芦丁糖苷 (6) 、rhamnocitrin 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (l→4) -O-α-L-rhamnopyranosyl (1→6) ]-β-D-galactopyranoside (7) 。化合物1～6的IC50<100μg/mL。结论 化合物2～6为首次从该属植物中分离得到, 化合物1为首次从该植物中分离得到。化合物1～3、5～6对HL-60细胞具有一定的毒性抑制作用, 化合物2～6对K562细胞具有一定的毒性抑制作用。
关键词： 异叶败酱; 化学成分; 分离鉴定; 生物活性;
Abstract： AIM To study the chemical constituents from Patrinia heterophylla Bunge. and their biological activities.METHODS The 75% ethanol extract from P. heterophylla was isolated and purified by macroporous resin, silica, medium pressureand liquid phase and semi-preparative HPLC, then the structures of obtained compounds were identified by physicochemical properties and spectral data. The activities of inhibiting leukemia cells HL-60 and K562 were detected by CCK-8 method. RESULTS Seven compounds were isolated and identified as patrinoside (1) 、roseoside Ⅱ (2) 、 (3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl- (1→6) -β-D-glucopyranoside (3) 、apigenin4′-O-β-D-glucopyranoside (4) 、fissoside B (5) 、apigenin-7-O-β-D-lutinoside (6) 、rhamnocitrin 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (l→4) -O-α-L-rhamnopyranosyl (1→6) ]-β-D-galactopyranoside (7) . IC50 values of compounds 1-6 were below 100 μg/mL.CONCLUSION Compounds 2-6 are isolated from genus Patrinia for the first time, and compound 1 is isolated from this plant for the first time. Compounds 1-3 and 5-6 have a certain toxicity inhibition effects on HL-60 cells, while compounds 2-6 have a certain toxic inhibitory effects on K562 cells.
Keyword： Patrinia heterophylla Bunge; chemical constituents; isolation and identification; biological activities;
异叶败酱Patrinia heterophylla Bunge是败酱科败酱属多年生草本植物, 其根茎或根与糙叶败酱的根茎或根混用, 药材名墓头回[1]。文献报道墓头回对各类急慢性白血病细胞有抑制作用, 并且临床上用于治疗白血病[2-3]。异叶败酱作为墓头回的药源植物, 对其化学成分报道较少, 为进一步明确异叶败酱中的药效物质基础, 本实验对异叶败酱进行化学成分研究, 并对其单体化合物进行抗肿瘤活性筛选。从中分离得到7个化合物, 化合物2～6均为首次从该属植物中分离得到, 化合物1为首次从该植物中分离得到, 化合物1～6对白血病细胞有一定的抑制作用。
1、 仪器与材料
高效液相色谱仪 (日本 Hitachi公司) ;2000ES蒸发光散射检测器 (美国Altech公司) ;R1-102示差检测器 (日本Shodex公司) ;NP7000半制备液相泵 (汉邦公司) ;R200旋转蒸发仪、中压反相色谱柱 (瑞士Buchi公司) ;Bruker AV-Ⅲ HD 600超导核磁共振仪 (瑞士Bruker公司) ;Q-TOF高分辨质谱仪 (美国Sciex公司) ; YT-CJ-1ND 超净工作台 (北京亚泰科隆技术有限公司) ;MCO-15ACCO2 恒温培养箱 (日本Sanyo公司) ;DT5-2离心机 (北京时代北利离心机有限公司) ;1420-012酶标仪 (美国Perkin Elmer公司) ;ECLIPSE TS100显微镜 (日本Nikon公司) ;D-101大孔树脂 (天津南开和成科技有限公司) ;薄层层析硅胶GF254、柱层析硅胶100～200目 (青岛海洋化工厂) 。分析纯石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等试剂 (国药集团化学试剂有限公司) ;色谱纯甲醇、乙腈 (国药集团化学试剂有限公司) ;娃哈哈纯净水 (杭州娃哈哈公司) 。RPMI 1640 培养基 (美国Gibco公司) ;胎牛血清 (美国HyClone公司) ;二甲基亚砜 (美国Amresco公司) ;CCK-8试剂盒 (Biosharp生物科技公司) 。
异叶败酱于2014年采于河南省, 经中国人民解放军总医院刘萍研究员鉴定为正品。
人早幼粒白血病细胞 (HL-60) 、人慢性粒细胞白血病细胞 (K562) 均购于中国医学科学院肿瘤医院细胞中心。
2、 提取与分离
干燥的异叶败酱全草 (2 kg) 粉碎, 75%乙醇回流提取3次, 过滤后减压浓缩得异叶败酱总浸膏。总浸膏加水成悬浮液, 依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次, 取有机相层, 用旋转蒸发仪减压浓缩, 回收溶剂, 分别得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位63、112、36、95 g。取正丁醇部分用大孔树脂色谱进行分离, 依次用30%、60%、95%乙醇进行梯度洗脱, 减压浓缩后得到30%、60%、95%部分浸膏。
将30%部分浸膏 (50 g) 经硅胶柱 (100～200 目) 分离, 以氯仿-甲醇-水 (25∶1∶0、9∶1∶0、9∶1∶0.1、8∶2∶0.2、7∶3∶0.5) 梯度洗脱, 共得到263个馏分A1-263, 通过薄层色谱检测, 合并相同馏分。馏分A180-190合并后经硅胶柱, 以氯仿-甲醇-水 (9∶1∶0.1、8∶2∶0.2) 梯度洗脱, 再经半制备HPLC (乙腈-水 2∶8) 得化合物1 (21.5 mg) 。馏分A120-159合并后经中压反相柱以乙腈-水 (1∶9、3∶17、1∶4、1∶3、3∶7) 梯度洗脱, 得化合物2 (12.1 mg) 。
将60%部分的浸膏经硅胶柱色谱 (100～200 目) 分离, 经氯仿-甲醇-水 (9∶1∶0.1、8∶2∶0.2、7∶3∶0.5) 梯度洗脱, 共得到245个馏分B1-245, 通过薄层色谱检测, 合并相同馏分。馏分B93-100合并后经中压反相柱以甲醇-水 (5∶95～55∶45) 梯度洗脱得化合物3 (11 mg) 。馏分B60-70号合并后经中压反相柱以乙腈-水 (3∶97～48∶52) 梯度洗脱, F23重结晶得化合物4 (16.4 mg) , F26重结晶得化合物5 (9.1 mg) 。馏分B77-91号合并后经中压反相柱以甲醇-水 (5∶95～80∶20) 梯度洗脱, F30重结晶得化合物6 (8.8 mg) , F40重结晶得化合物7 (10.6 mg) 。
3、 结构鉴定
化合物1:白色粉末 (甲醇) 。ESI-MS m/z:485[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 1.78 (1H, m, H-13) , 2.03 (2H, m, H-6) , 2.13 (1H, m, H-9) , 2.19 (2H, dd, J=7.2 Hz, H-12) , 2.95 (1H, q, J=7.8 Hz, H-8) , 3.15 (1H, t, J=8.4 Hz, H-7) , 3.24 (2H, m, H-10) , 4.04 (1H, d, J=11.4 Hz, H-1) , 4.22 (1H, m, H-11) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 93.5 (C-1) , 140.0 (C-3) , 116.4 (C-4) , 34.1 (C-5) , 40.9 (C-6) , 73.3 (C-7) , 49.0 (C-8) , 42.7 (C-9) , 62.2 (C-10) , 69.6 (C-11) , 103.4 (C-1′) , 75.1 (C-2′) , 78.1 (C-3′) , 71.7 (C-4′) , 77.9 (C-5′) , 62.8 (C-6′) , 173.3 (C-1″) , 44.1 (C-2″) , 26.8 (3″) , 22.6 (4″) 。以上数据与文献[4]一致, 故鉴定为patrinoside。
化合物2:黄色粉末 (甲醇) 。ESI-MS m/z:677[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 2.10 (1H, d, J=16.8 Hz, H-2) , 2.47 (1H, d, J=16.8 Hz, H-2) , 5.81 (1H, quin, H-4) , 4.36 (1H, m, H-9) , 1.21 (3H, d, J=6.6 Hz, H-10) , 0.90 (3H, s, H-11) , 0.91 (3H, s, H-12) , 1.86 (3H, d, J=1.2 Hz, H-13) , 4.28 (3H, d, J=7.8 Hz, Glu-1′) ;13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 42.4 (C-1) , 50.6 (C-2) , 201.1 (C-3) , 127.1 (C-4) , 167.2 (C-5) , 79.9 (C-6) , 131.5 (C-7) , 135.2 (C-8) , 77.2 (C-9) , 21.1 (C-10) , 23.4 (C-11) , 24.6 (C-12) , 19.5 (C-13) , 102.7 (C-1′) , 75.2 (C-2′) , 78.1 (C-3′) , 71.6 (C-4′) , 77.9 (C-5′) , 62.8 (C-6′) 。以上数据与文献[5]一致, 故鉴定为roseoside Ⅱ。
化合物3:白色粉末 (甲醇) 。ESI-MS m/z:951[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3.06 (1H, dd, J=4.8 Hz, H-3) , 5.20 (1H, brs, H-12) , 4.21 (1H, d, J=8.4 Hz, H-Ara-1) , 4.29 (1H, d, J=8.4 Hz, H-Glu-1′) , 5.30 (1H, d, J=7.8 Hz, H-Glu-1) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 39.8 (C-1) , 27.0 (C-2) , 90.7 (C-3) , 40.1 (C-4) , 57.0 (C-5) , 19.3 (C-6) , 33.9 (C-7) , 40.7 (C-8) , 49.0 (C-9) , 37.9 (C-10) , 24.5 (C-11) , 123.8 (C-12) , 144.8 (C-13) , 42.8 (C-14) , 28.9 (C-15) , 24.0 (C-16) , 49.0 (C-17) , 41.8 (C-18) , 41.4 (C-19) , 36.7 (C-20) , 29.2 (C-21) , 32.4 (C-22) , 28.5 (C-23) , 16.9 (C-24) , 16.1 (C-25) , 17.8 (C-26) , 26.3 (C-27) , 178.0 (C-28) , 74.3 (C-29) , 107.1 (C-Ara-1) , 78.1 (C-Ara-2) , 72.8 (C-Ara-3) , 69.5 (C-Ara-4) , 66.3 (C-Ara-5) , 95.7 (C-Glu-1) , 73.8 (C-Glu-2) , 78.0 (C-Glu-3) , 70.9 (C-Glu-4) , 78.0 (C-Glu-5) , 69.5 (C-Glu-6) , 104.6 (C-Glu-1′) , 75.4 (C-Glu-2′) , 78.0 (C-Glu-3′) , 71.5 (C-Glu-4′) , 77.8 (C-Glu-5′) , 62.7 (C-Glu-6′) 。以上数据与文献[6]一致, 故鉴定为 (3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl- (1→6) -β-D-glucopyranoside。
化合物4: 黄色晶体 (DMSO) 。ESI-MS m/z:455[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 7.95 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, 6′) , 6.93 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3′, 5′) , 6.82 (1H, s, H-3) , 5.06 (1H, d, J=7.8 Hz, H-Glu-1) , 3.76 (1H, s, H-Glu-6) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 182.0 (C-4) , 164.2 (C-7) , 162.9 (C-2) , 161.4 (C-4′) , 161.1 (C-9) , 156.9 (C-5) , 128.6 (C-2′, C-6′) , 121.0 (C-1′) , 116.0 (C-3′, C-5′) , 105.3 (C-10) , 103.1 (C-3) , 99.9 (C-Glu-1) , 99.5 (C-6) , 94.8 (C-8) , 77.2 (C-Glu-3) , 76.4 (C-Glu-5) , 73.1 (C-Glu-2) , 69.5 (C-Glu-4) , 60.6 (C-Glu-6) 。以上数据与文献[7]一致, 故鉴定为 apigenin4′-O-β-D-glucopyranoside。
化合物5:白色针晶 (DMSO) 。ESI-MS m/z:483[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 5.00 (1H, m, H-10) , 4.78 (1H, s, H-10) , 4.58 (1H, s, H-1″) , 4.35 (1H, d, J=7.8 Hz, H-3) , 4.23 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1′) , 2.42 (1H, t, J=5.4 Hz, H-1) , 2.28 (1H, m, H-7) , 1.63 (1H, d, J=9.6 Hz, H-7) , 2.12 (1H, m, H-4) , 1.95 (1H, overlap, H-4) , 1.23 (3H, s, H-8) , 0.61 (3H, s, H-9) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 150.8 (C-2) , 113.4 (C-10) , 101.1 (C-1′) , 100.9 (C-1″) , 76.6 (C-3′) , 75.2 (C-5′) , 73.3 (C-2′) , 71.8 (C-3) , 70.7 (C-4′) , 70.5 (C-3″) , 70.3 (2″) , 68.3 (C-5″) , 67.2 (C-6′) , 50.0 (C-1) , 40.3 (C-6) , 39.9 (C-5) , 31.9 (C-4) , 26.8 (C-7) , 25.8 (C-8) , 21.9 (C-9) , 17.9 (C-6″) 。以上数据与文献[8]一致, 故鉴定为fissoside B。
化合物6:黄色晶体 (DMSO) 。ESI-MS m/z:577[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 1.07 (3H, d, J=6.0 Hz, H-6?) , 4.54 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1?) , 5.06 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1″) , 6.44 (1H, s, H-6) , 6.76 (1H, s, H-8) , 6.85 (1H, s, H-3) , 6.95 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3′, H-5′) , 7.95 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, H-6′) , 10.37 (1H, s, 4′-OH) , 12.95 (1H, s, 5′-OH) ;13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 17.8 (C-6?) , 66.0 (C-6″) , 68.3 (C-5?) , 69.5 (C-2?) , 70.3 (C-3?) , 70.7 (C-4″) , 72.0 (C-2″) , 73.1 (C-4?) , 75.6 (C-3″) , 76.3 (C-5″) , 94.8 (C-8) , 99.5 (C-6) , 99.9 (C-1?) , 100.5 (C-1″) , 103.1 (C-3) , 105.4 (C-10) , 116.1 (C-3′) , 121.0 (C-1′) , 128.6 (C-2′, C-6′) , 156.9 (C-9) , 161.2 (C-4′) , 161.3 (C-7) , 162.9 (C-5) , 164.4 (C-2) , 182.0 (C-4) 。以上数据与文献[9]一致, 故鉴定为芹菜素-7-O-β-D-芦丁糖苷。
化合物7:黄色晶体 (甲醇) 。ESI-MS m/z:807[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3.83 (3H, s, H-7) , 5.01 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1″) , 6.29 (1H, d, J=7.2 Hz, H-6) , 6.55 (1H, s, H-8) , 6.83 (2H, d, J=9.0 Hz, H-3′, H-5′) , 8.07 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, H-6′) ;13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 179.7 (C-4) , 167.4 (C-7) , 162.7 (C-5) , 161.8 (C-4′) , 159.7 (C-9) , 158.5 (C-2) , 135.9 (C-3) , 132.6 (C-2′, C-6′) , 122.5 (C-1′) , 116.2 (C-3′) , 106.5 (C-10) , 105.5 (C-1″) , 104.0 (C-1″″) , 101.9 (C-1?) , 99.2 (C-6) , 93.3 (C-8) , 79.6 (C-4?) , 75.4 (C-5″) , 75.0 (C-3″) , 74.0 (C-4″″) , 73.2 (C-3″″) , 73.0 (C-2″″) , 72.2 (C-2″) , 72.1 (C-3?) , 71.9 (C-2?) , 70.2 (C-5″″) , 70.0 (C-5?, C-4″) , 67.6 (C-6″) , 56.6 (C-OMe) , 18.0 (C-6″″) , 18.0 (C-6?) 。以上数据与文献[10]一致, 故鉴定为rhamnocitrin 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (l→4) -O-α-L-rhamnopyranosyl (1→6) ]-β-D-galactopyranoside。
4、 活性测试
4.1、 细胞培养
将细胞从液氮罐中取出, 常规方法[11-12]复苏, 将细胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640培养液, 在37 ℃, 5%CO2 饱和湿度条件下培养。根据不同细胞的生长速度1～2 d更换新鲜的培养液或者传代。
4.2、 CCK-8检测
将处于对数生长期的HL-60、K562细胞制成密度9×104/mL、8×104/mL的细胞悬液接种于96孔板中, 每孔100 μL, 每组设置5个平行孔。在培养箱中培养24 h后分别加入不同质量浓度的化合物1～6 (从低到高依次为0、20、40、60、80、100 μg/mL) 及阳性对照品顺铂50 μL。给药后继续在培养箱中培养48 h, 取出培养板, 每孔加入10 μL CCK-8 溶液。1～2 h (K562 1.5 h, HL-60 2 h) 后在450 nm处测OD值。并计算细胞抑制率及IC50值。
4.3、 对白血病细胞增殖抑制活性测定
各化合物的IC50值见表1。据相关文献报道[13], 单体化合物的IC50<100 μg/mL, 表明实验样品具有明显的细胞毒活性。结果显示, 化合物1～3、5～6对HL-60细胞具有一定的毒性抑制作用, 化合物2～6对K562细胞具有一定的毒性抑制作用。
5、 讨论
异叶败酱是墓头回最早的药源植物[14], 是历代本草中以墓头回使用的主流, 但是关于异叶败酱的化学成分报道却很少, 目前国内外有12个三萜类、5个环烯醚萜酯、3个木脂素、2个甾体类、3个黄酮类、1个多糖和1个香豆素类化合物的报道。异叶败酱总皂苷和粗制剂可用于治疗急慢性白血病、子宫癌、宫颈癌和大肠癌[15], 但是其发挥药效的确切化合物尚未确定。本研究从异叶败酱中分离得到7个化合物, 其中化合物1为环烯醚萜类、化合物2为单环降倍半萜苷类、化合物3为三萜皂苷类、化合物5为单萜类龙脑苷、化合物4、6～7为黄酮类。通过CCK-8法筛选了化合物1～6对HL-60和K562细胞的增殖抑制作用。结果显示, 各单体化合物对白血病细胞具有一定的毒性抑制作用, 且化合物1～3、5～6对HL-60细胞、化合物2～6对K562细胞的抑制作用与药物质量浓度有一定的依赖关系, 以期为今后进一步研究异叶败酱的抗白血病作用提供参考。虽然单体化合物对白血病细胞表现出了体外毒性, 但中药成分复杂, 异叶败酱化学成分抗白血病作用的确切机制还需进一步研究。
表1 各化合物抗白血病细胞IC50值 (μg/mL)
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