中文摘要
野菊（Chrysanthemum indicum）广泛分布于中国的东北、华北、华中、华南以及西南各地区，叶片呈现羽状半裂或者浅裂，具有黄色的舌状花。毛华菊（Chrysanthemumvestitum）主要原产于中国的湖北省、河南省及安徽省。根据形态学特征和地理分布，毛华菊可以分为两个变种：狭叶毛华菊（Chrysanthemum vestitum var. vestitum）和阔叶毛华菊（Chrysanthemum vestitum var. latifolium）。前者分布于湖北省宜昌和河南省伏牛山，叶片较狭，呈现卵状披针形。而后者主要分布于安徽省西部大别山和天柱山，叶片呈现卵圆形。野菊和毛华菊具有倍性的差异，前者为四倍体，后者为六倍体。在毛华菊和野菊的同域分布区，毛华菊的花期稍早于野菊，二者存在花期相遇。我们观察到一些具有中间形态特征的个体，推测它们可能是这毛华菊和野菊种间的自然杂交种。
本研究使用13对微卫星引物对安徽等9个采集地点的共317个个体开展了分子标记，包括 75 个阔叶毛华菊、83 个狭叶毛华菊、134 个野菊和 25 个疑似自然杂交种。
我们对部分个体的叶绿体 trnL-trnF 序列进行了测序，包括 22 个阔叶毛华菊、32 个狭叶毛华菊、42 个野菊和 17 个疑似自然杂交种。我们基于 13 对微卫星引物进行了STRUCTURE 聚类分析和主坐标（PCO）分析。我们基于叶绿体 trnL-trnF 序列进行了单倍型分析。此外，我们还对部分个体进行了形态学分析。
基于 13 对微卫星引物的 STRUCTURE 聚类分析和主坐标（PCO）分析结果表明，阔叶毛华菊、狭叶毛华菊和野菊之间具有明显的遗传分化。野菊和毛华菊之间存在不同程度的自然杂交和基因渐渗。大多数居中表型的疑似自然杂交种被鉴定为野菊和狭叶毛华菊之间的杂交或回交后代。而部分疑似自然杂交种在形态上与野菊或者毛华菊相似。基于叶绿体的 trnL-trnF 序列的单倍型分布图显示，单倍型 Hap_1 为各个种群的野菊和毛华菊共有单倍型，大多数种群具有其独特的单倍型，疑似自然杂交种尚未具备其特有单倍型。基于叶片形态特征的主成分（PCA）分析结果表明，野菊、阔叶毛华菊和狭叶毛华菊个体间的 PC1 和 PC2 的变异率分别为 51.24 % 和 15.74 % 。
以上研究结果表明，野菊和毛华菊存在较为频繁的自然杂交，这可能是由于四倍体和六倍体之间的生殖隔离较弱。
关键词：叶绿体 trnL-trnF 序列；菊属；形态测定；自然杂交；微卫星标记
Abstract
Chrysanthemum indicum is widely distributed in northeast China, north China, centralChina, south China and southwest China, with pinnate or lobed leaves and yellowtongue-shaped flowers. Chrysanthemum vestitum was divided into two varieties: C. vestitumvar. vestitum and C. vestitum var. latifolium based on leaf morphology and distribution. TheC. vestitum var. vestitum has ovate-lanceolate leaves and is distributed in Yichang, Hubeiprovince and the Funiu Mountains, Henan province whereas C. vestitum var. latifolium hasovoid leaves and is mainly distributed in Dabie Mountains and Tianzhu Mountains, Anhuiprovince. There is a differing ploidy level between C. indicum and C. vestitum with theformer reported as tetraploid and the latter reported as hexaploid. Within areas where C.
indicum and C. vestitum co-occour, their flowering periods partially overlap despite that C.
vestitum flowered slightly earlier than C. indicum. We observed some individuals withintermediate morphological characters between C. indicum and C. vestitum and these mayrepresent putative hybrids between the two species.
In this study, we genotyped 317 individuals using 13 SSRs, representing 75 C. vestitumvar. latifolium, 83 C. vestitum var. vestitum, 134 C. indicum and 25 putative hybrids. Wesequenced chloroplast trnL-trnF for a subset of individuals, including 22 C. vestitum var.
latifolium, 32 C. vestitum var. vestitum, 42 C. indicum and 17 putative hybrids. Weperformed STRUCTURE and principal coordinate analysis（PCO）based on the 13 SSRs.
We carried out haplotype analysis based on the trnL-trnF fragment. In addition, weperformed morphometric analyses for a subset of individuals.
The result of STRUCTURE and principal coordinate analysis（PCO） based on the 13SSRs, identified three genetic clusters, corresponding to C. vestitum var. latifolium, C.
vestitum var. vestitum and C. indicum. The results also showed that there were differentdegrees of revealed natural hybridization and gene introgression between C. indicum and C.
vestitum. Most of the putative hybrids with intermediate morphological characters between C. indicum and C. vestitum were identified as hybridization or backcrossing between C.
vestitum and C. indicum. Some individuals morphologically resembling C. indicum or C.
vestitum were identified as hybrids based on STRUCTURE clustering analysis. Thehaplotype distribution map based on the trnL-trnF fragments showed that the haplotypesHap_1 was shared by C. indicum and C. vestitum and most populations also have their ownunique haplotypes. Suspected natural hybrids have no their unique haplotype.The principalcomponent analysis（PCA）based on leaf morphology separated C.indicum, C.vestitum andC.vestitum var. latifolium with PC1 and PC2 explaining 51.24 % and 15.74 % of variation,respectively.
In summary, frequent hybridization has occurred between C. indicum and C. vestitum,possibly due to the weak reproductive isolation between the tetraploids and the hexaploids.
Key words: Chloroplast trnL-trnF; Chrysanthemum; Morphometrics; Naturalhybridization; SSRs
目录
中文摘要......................................................................................................................................I
Abstract....................................................................................................................................III
1 前言......................................................................................................................................... 1
1.1 刺槐的特征与用途................................................................................................................1
1.1.1 多花刺槐特征特性.............................................................................................................1
1.1.2 粘枝刺槐特征特性.............................................................................................................2
1.1.3 蜜源 1 号特征特性.............................................................................................................2
1.1.4 多彩青山特征特性.............................................................................................................2
1.1.5 辽刺兴 22 特征特性...........................................................................................................3
1.1.6 鲁刺 58 特征特性...............................................................................................................3
1.2 蜜源植物................................................................................................................................3
1.3 花卉生化性质........................................................................................................................4
1.3.1 花卉中医药学研究.............................................................................................................4
1.3.2 刺槐花的营养成分和活性物质.........................................................................................5
1.4 刺槐花展示............................................................................................................................6
1.4.1 花期.....................................................................................................................................6
1.4.2 花量.....................................................................................................................................6
1.5 蜜腺........................................................................................................................................7
1.5.1 蜜腺的分布和类型.............................................................................................................7
1.5.2 蜜腺的结构与发育.............................................................................................................7
1.5.3 刺槐泌蜜规律.....................................................................................................................8
1.6 蜂蜜.......................................................................................................................................8
1.6.1 蜂蜜的营养成分及活性物质............................................................................................8
1.6.2 蜂蜜的效用.......................................................................................................................10
1.6.3 刺槐蜜..............................................................................................................................11
1.7 研究目的与意义..................................................................................................................11
1.8 技术路线..............................................................................................................................13
2 材料与方法........................................................................................................................... 13
2.1 研究内容.............................................................................................................................13
2.2 试验材料与仪器试剂.........................................................................................................13
2.2.1 试验采样地概况与采样品种...........................................................................................13
2.2.2 试验仪器与试剂...............................................................................................................14
2.3 刺槐花营养成分和活性物质检测与分析..........................................................................15
2.3.1 取样及试样制备...............................................................................................................15
2.3.2 检测内容及方法...............................................................................................................15
2.3.3 测定总糖含量...................................................................................................................15
2.3.4 测定还原糖含量...............................................................................................................16
2.3.5 测定蛋白质含量...............................................................................................................17
2.3.6 测定 L(+)-抗坏血酸含量.................................................................................................18
2.3.7 测定总黄酮含量...............................................................................................................19
2.3.8 测定总皂苷含量...............................................................................................................19
2.3.9 测定花青素含量...............................................................................................................20
2.4 刺槐花蜜腺石蜡切片..........................................................................................................21
2.4.1 选树择花...........................................................................................................................21
2.4.2 试验内容...........................................................................................................................21
2.4.3 试验流程...........................................................................................................................21
2.5 不同品种刺槐花展示观测..................................................................................................22
2.5.1 选取目标树.......................................................................................................................22
2.5.2 统计内容...........................................................................................................................23
2.5.3 统计方法...........................................................................................................................23
3 结果与分析........................................................................................................................... 23
3.1 刺槐花营养成分和活性物质检测......................................................................................23
3.1.1 检测结果...........................................................................................................................24
3.1.2 检测结果分析...................................................................................................................24
3.2 刺槐花蜜腺切片结果与分析..............................................................................................26
3.3 刺槐花展示特性调查..........................................................................................................29
3.3.1 花期天数...........................................................................................................................29
3.3.2 花序量比较结果...............................................................................................................30
3.3.3 小花大小比较结果...........................................................................................................30
4 讨论....................................................................................................................................... 31
4.1 刺槐花营养成分试验..........................................................................................................31
4.2 刺槐花蜜腺研究..................................................................................................................32
4.3 刺槐花展示可能影响因素..................................................................................................33
5 结论....................................................................................................................................... 34
5.1 刺槐花营养成分和活性物质..............................................................................................34
5.2 刺槐花蜜腺位置及发育动态..............................................................................................34
5.3 刺槐花展示对比..................................................................................................................34
参考文献................................................................................................................................... 36
附录........................................................................................................................................... 44
致谢........................................................................................................................................... 45
硕士期间发表论文情况........................................................................................................... 47
1 引言
1.1 研究背景
1.1.1 自然杂交
自然杂交（natural hybridization）是指在自然条件下，具有遗传差异的个体之间成功交配的生物学过程（Arnold, 1992），既可以发生在不同物种之间，又可以发生在同一物种的不同种群之间。自然杂交重要的进化意义（Abbott, 1992; Arnold, 1997）主要表现在：一方面，自然杂交能够增加物种的遗传多样性，提高种群的适合度（Ellstrand& Schierenbeck, 2000; Abbott et al., 2013; Stelkens et al, 2014; Yakimowski & Rieseberg,2014; Frankham, 2015）；另一方面，自然杂交可以产生适应性渐渗（adaptiveintrogression）, 增强物种对环境的适应性（Anderson, 1953; Rieseberg et al., 1989;Rhymer & Simberloff, 1996; Mallet, 2005; Fitzpatrick & Shaffer, 2007; Vuillaume et al.,2015）。
相关研究发现，至少存在 25 % 的植物在其物种进化历程中经历了与其近缘物种的自然杂交（Mallet, 2007），特别像松科（Isoda et al., 2000）、桦木科（Zohren et al.,2016; Hu et al., 2019）、蔷薇科（朱弘等, 2020）等近缘类群中。同时发现相对于一年生植物，多年生植物具有更高的自然杂交频率，并且在经历快速辐射进化的近缘植物物种之间自然杂交出现更加频繁（Stace, 1975; Stelkens et al., 2014）。
1.1.1.1 自然杂交与物种形成
自然杂交能够促进物种形成（Abbott, 1992; Arnold et al., 2003; Rieseberg et al.,2003）。常见的物种形成方式是多倍化（Abbott, 2003）。对于某些多倍体物种，染色体加倍使后代与亲本物种之间产生了生殖隔离（Mallet, 2007）。在自然条件下，相较于同倍体杂交物种的形成，异源多倍体杂交物种的形成更为常见，并且异源多倍体被认为能够“瞬间”形成新物种（Soltis et al., 2014; 王玉国, 2017）。例如，二倍体物种轮叶报春（Primula verticillata）和二倍体物种多花报春（P. floribunda），二者发生杂交，形成了四倍体物种邱园报春（P. kewensis）（Ramsey & Schemske, 2002）。
1.1.1.2 自然杂交与基因渐渗
自然杂交可以导致基因渐渗（gene introgression），即两个物种之间发生杂交，获得了可育的杂交后代，当某些杂交个体与亲本反复回交时，就可能出现跨越生殖障碍的遗传物质转移的生物学过程（Anderson & Hubricht, 1938）。在自然条件下，基因渐渗通常不能够形成新的物种，但若某些可育的杂交个体与亲本种群不再发生回交，或者杂交后代占据了新的生境，就可能形成新的物种（Abbott, 2003）。
1.1.2 自然杂交的研究方法
1.1.2.1 形态学分析
形态学分析是系统学研究的基本方法之一，是最容易观察和计量测定的，并且通常具有一定的进化意义（戴思兰等, 2002）。长期以来，植物系统学都是以形态学特征为基础的分类标准，特别是花及果实等相对保守的特征（李世茂, 2010）。一般情况下，与亲本物种相比，自然杂交产生的 F代通常呈现出介于两个亲本物种之间的居中表型（Grant, 1981; Horie, 2012; Song et al., 2015）。例如，掌叶秋海棠（Begonia hemsleyana）的叶片被毛少，且具有明显的地上茎，而变色秋海棠（B. versicolor）的叶片颜色和斑纹变化大、叶片无裂、被毛多，且无地上茎。两个亲本物种之间的杂交 F代，不仅叶片颜色和斑纹出现了较多变化、叶片深或浅裂、被毛较多，且具有较短的直立茎（田代科等, 2017）。因此，一般对物种形态进行观察和分析，可以初步鉴定早期的自然杂交个体。
然而，形态学分析也有其局限性，例如物种经历了多代杂交后，杂交种与其亲本物种在形态学特征上的差异会越来越小，性状可能呈现出连续性变化，以致于难以通过形态特征判断物种之间是否产生了杂交（Rieseberg & Wendel, 1993）。此外，形态学性状容易受到外界环境的影响（李仁伟等, 2012; 杨菁, 2016）。因此，仅仅依靠物种的形态学特征来鉴定自然杂交个体，往往不够准确。若要更加科学精准地确定是否为自然杂交种，还需要更多方面的证据（Edwards & Knowles, 2014）。
1.1.2.2 分子标记方法
分子标记（Molecular markers）是以个体之间的核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是在 DNA 分子水平上，对遗传多态性的直接反映，能够更加精准地揭示物种之间和物种内部的差异。同时，分子标记方法相对稳定，不易受到环境的影响，能够为物种分类和系统发育提供有效的信息（Liu et al., 2012）。
本研究采用了微卫星标记（microsatellite），又称简单重复序列标记（simplesequence repeat, SSR），或者短串联重复序列（short tandem repeat, STR）。微卫星标记的核心单位是 1-6 bp 的短核苷酸。其多态性在于核心短核苷酸序列不同的重复次数（Ashley & Dow, 1994）。其原理是根据两端的保守单拷贝序列，设计出特异性引物，通过 PCR 扩增和毛细管电泳分析技术，即可检测扩增片段的多态性。微卫星标记的优势主要在于：（1）基因等位位点较多，加之突变率较高，因而具有较高的多态性；（2）以 PCR 扩增为基础，所需 DNA 量少，对 DNA 的质量要求不高；（3）扩增片段长度较短，易扩增，一般为 100-300 bp；（4）对引物采用不同颜色的荧光进行标记，进行多重 PCR，不仅提高了准确性，还降低了成本（Guichoux et al., 2011）；（5）重复性和稳定性好，不同研究获得的扩增结果较为一致（Saghai et al., 1994）。
目前，微卫星标记已经广泛应用于研究物种的自然杂交（Hanemaaijer et al., 2018）、基因渐渗（Randi, 2008; Dudek et al., 2019）、群体遗传结构（Haasl & Payseur, 2011;Barriball et al., 2015）以及杂交种鉴定等（Rachit et al., 2010）。微卫星标记在菊属植物的亲缘关系和系统进化等研究中也已经得到了较为成熟的应用（Wang et al., 2013;Zhang et al., 2014; Sang et al., 2015）。例如，Jo 等利用 16 个微卫星标记，对 50 个菊花栽培品种进行了系统发育分析，并成功地揭示了其遗传多样性（Jo et al., 2015）。
Feng 等验证了 17 个新的 EST-SSR 标记，并选取了 55 个微卫星标记对菊花栽培品种进行了遗传多样性分析，结果显示，微卫星引物的平均多态性信息含量为 0.972（0.938-0.993），不同菊花栽培品种之间具有较高的遗传多样性（Feng et al., 2013）。
微卫星标记需要根据已知物种基因微卫星位点两侧的序列来设计引物，这些SSR引物的序列一般通过直接测序和构建 SSR 基因文库等，筛选微卫星位点而获得（Zaneet al., 2002）。近年来，随着科学技术的快速发展，对有重要经济价值的栽培植物已经进行了大量的基因组测序。由于开发新的微卫星引物难度较大，且费用较高，而源自相同祖先的物种，其基因序列上往往具有较高的同源性。因此，从已开发较多微卫星引物的近缘种中，筛选出研究物种所需的微卫星引物的方法得到了广泛应用（Kalia etal., 2011; Barbará et al., 2007）。
…………由于本文篇幅较长,部分内容省略,详细全文见文末附件
3 结果与分析
3.1 形态学鉴定结果及分析
3.1.1 花和叶片的形态对比图
在采集材料中，我们选取了部分具有典型特征的花和叶片，得到其形态对比图（图7，图 8）。可以看出，野菊、狭叶毛华菊、阔叶毛华菊以及疑似自然杂交种，在花色、叶片形态以及大小等方面均呈现出明显差异。具体表现在：野菊为黄色小花，毛华菊为白花，阔叶毛华菊的花径稍大于狭叶毛华菊。野菊多数个体叶片具有六个明显深裂，叶缘具有不规则锯齿，毛华菊多数个体叶片无明显深裂，具有数量不等的不规则浅裂，部分个体叶缘具有不规则锯齿。表型居于毛华菊与野菊之间的疑似自然杂交种的花色呈现出浅黄色，花径介于野菊与毛华菊之间，更接近狭叶毛华菊，叶片形态变异丰富，其中部分个体接近野菊，具有六个明显深裂，叶缘具有不规则锯齿，部分个体接近狭叶毛华菊，具有数量不等的不规则浅裂。
3.1.2 基于叶片标志点的主成分分析聚类结果
对获得的叶片标志点信息进行主成分（PCA）分析，聚类结果（图 9）表明，第一主成分（PC1）将毛华菊与野菊分开，解释了 40.85 % 的叶片之间的变异（图 9A）和 51.24 % 的个体之间的变异（图 9 B），第二主成分将毛华菊分成两种不同的类型（图 9 B），即阔叶毛华菊以及狭叶毛华菊，并解释了 15.74 % 的个体之间的变异。
个体之间的的聚类效果明显优于叶片之间的聚类效果。表型介于野菊与毛华菊之间的疑似自然杂交种中的多数个体聚为狭叶毛华菊一类，少数个体聚为野菊一类。
3.2 微卫星鉴定结果及分析
3.2.1 Structure 聚类分析结果
对获得的微卫星数据进行 STRUCTURE 聚类分析，借助 STRUCTURE Harvester计算出最佳遗传聚类值。结果表明，（Evanno et al., 2005），最佳 K 值为 3（图 10），研究种群被分为三个聚类，分别是野菊、狭叶毛华菊及阔叶毛华菊（图 11）。将遗传混合大于 10 % 的个体认为是自然杂交或回交个体，则鉴定出 4 个阔叶毛华菊与野菊之间的自然杂交或回交个体、24 个狭叶毛华菊与野菊之间的自然杂交或回交个体、1个阔叶毛华菊与狭叶毛华菊之间的自然杂交或回交个体，以及 3 个阔叶毛华菊、狭叶毛华菊与野菊之间的自然杂交或回交个体（图 11）。
其中，4 个阔叶毛华菊与野菊之间的自然杂交或回交个体，均来自两个物种同域分布的安徽省天柱山种群（TZ），包括 1 个已鉴定形态学的野菊和 3 个阔叶毛华菊。
24 个狭叶毛华菊与野菊之间的自然杂交或回交个体中，1 个是河南省老君山（LJS）的野菊，3 个是河南省内乡（NX）的狭叶毛华菊，1 个是河南省省道 249（S）的疑似自然杂交种，4 个来自湖北省文佛山种群（WFS）（1 个野菊和 3 个狭叶毛华菊），以及 15 个来自河南省夏馆种群（XG）（2 个野菊、3 个狭叶毛华菊和 10 个疑似自然杂交种）。1 个阔叶毛华菊与狭叶毛华菊之间的自然杂交或回交个体是湖北省文佛山（WFS）的狭叶毛华菊。3 个阔叶毛华菊、狭叶毛华菊与野菊之间的自然杂交或回交个体中，2 个是湖北省文佛山（WFS）的狭叶毛华菊以及 1 个是河南省夏馆（XG）的狭叶毛华菊（图 11）。
当遗传聚类值即 K 值为 2 时，研究种群被分为两个聚类，分别是野菊以及毛华菊。当 K 值为 4 时，研究种群被分为四个聚类，分别是安徽省天柱山和白马尖的野菊、湖北省文佛山和河南省伏牛山的野菊、安徽省天柱山和白马尖的阔叶毛华菊、湖北省文佛山和河南省伏牛山的狭叶毛华菊（图 11）。
3.2.2 PCO 分析聚类结果
对获得的微卫星数据进行 PCO 分析，聚类结果表明（图 12），第一主成分 PC1将野菊与毛华菊分开，第二主成分 PC2 将毛华菊分成两个聚类，即阔叶毛华菊和狭叶毛华菊，这与 STRUCTURE 分析K=3 时的聚类结果一致（图 11）。
3.3 叶绿体 DNA 的 trnL-trnF 间隔序列结果与分析
3.3.1 序列信息
经过检查和校正，总计得到了用于后续相关分析的 106 个叶绿体 DNA 的trnL-trnF 间隔序列，其序列的长度为 815-822 bp，多态性位点共 13 个，其中单一突变位点 6 个，简约性信息位点 7 个。种群之间和种群内均存在不同程度的遗传变异，共计 13 个核苷酸取代和 9 个核苷酸插入缺失。基于这些核苷酸变异，总共鉴定出 12种单倍型。
参考文献
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