转基因食品的检测技术探究

食品生物技术论文第六篇：转基因食品的检测技术探究

 

　　摘要：重点介绍了几种先进的转基因食品的检测技术，如单管巢式和半巢式PCR、微滴数字PCR、液相芯片等技术，阐述了这些技术的基本原理、优缺点，并对其进行了展望。

 

　　关键词：转基因食品; 原理; 检测技术;

 

　　Research progress on detecting technology of genetically modified food

 

　　YANG Hong-miao SHEN Meng LIU Yang SHAO Juan-juan

 

　　College of Science and Technology, Hebei Agricultural University

 

　　Abstract：The detection of several advanced detection methods of genetically modified food, such as single-tube nested and semi-nested PCR, droplet digital PCR and liquid phase chips were introduced. Basic principles, advantages, disadvantages and prospects of these technologies were expounded and discussed.

 

　　由于转基因食品有着提高营养成分含量、增加食品产量和改进感官质量优势，转基因技术也在不断地发展，因此转基因食品的研究成为了许多国家大力开展的项目。国际市场上的转基因食品数量及种类日趋增长。然而人们对于转基因食品的安全性却有着较大的争议，有待进一步的研究和证明。美国和日本的许多人表示，他们完全能够在管理机构提供足够有关转基因食品安全健康信息的前提下接受转基因食品。此外，加拿大、澳大利亚、巴西及阿根廷也根据国际农业生物技术获得与应用协会的规定接受转基因食品，中国对此也持积极态度。而一些国家和组织则认为转基因食品在致过敏、致毒及致癌等方面仍存在着潜在风险。因此，本文针对转基因食品的检测介绍了几种最新的方法，目的是能够提供信息依据，进一步推动此类研究的发展。随着不断发展的转基因食品检测技术和科学家的认真研究，我们相信其安全性很快将会被证实。

 

　　1 转基因食品的概念及存在问题

 

　　1.1 转基因技术的基本原理

 

　　生物体中遗传信息的表达，是通过体内的遗传物质DNA的复制、转录和翻译完成的。转基因技术的理论基础是通过修饰改造生物体内的DNA分子，从而使生物体的遗传性状发生改变；转基因的操作技术是在基因克隆技术及DNA限制性内切酶的基础上进行完善的[1]。

 

　　1.2 转基因食品的概念

 

　　转基因食品，即基因修饰食品，是指以转基因生物为直接食品或以其为原料加工生产的食品。该类食品利用转基因技术，在一些物种中导入其他生物的基因，使它们的遗传物质发生改变，并在一些方面向人们所需要的目标转变，包括形状、营养品质、消费品质等。狭义上讲，应用分子生物学技术，将某些生物（包括动物、植物以及微生物）外源性基因转移到其他物种中，表达出的性状与原物种不同，以该类生物为原料制成的食品就是基因修饰食品。广义上是指产生的一种新的生物体表现型，除了利用转基因技术外，也可以通过修饰自身基因来获得，效果可等同于转基因。

 

　　1.3 转基因食品存在的问题

 

　　关于转基因的安全性问题，可以概括为以下几条：（1）在物质构成和化学成分等方面，转基因食品是否已经发生改变；（2）长时间食用转基因食品对人体产生的不良影响，是否会涉及到人类的发育与成长；（3）在生物链中，转基因食品的抗逆性是不是会带来负面效应；（4）产生基因污染的情况以及是否会进而污染到其他生物基因等[2]。

 

　　2 转基因食品的检测技术

 

　　2.1 单管巢式和半巢式PCR

 

　　单管巢式和半巢式PCR(single tube nested and semi-nested PCR）是以普通PCR、巢式和半巢式PCR反应为基础，经过进一步研究发展起来的一种PCR技术。该技术通过设置不对称的退火温度和设计特殊的内外引物，在同一反应管内完成PCR的2轮扩增，实现对靶标序列的扩增和检测，其结果特异性强、灵敏度高[3]。

 

　　姚芹等[4]从转基因精炼一级大豆油中提取DNA，并运用单管巢式PCR技术对其进行检测，准确地检测出了转基因成分，此实验为转基因大豆精炼油的检测提供了新的方法。闫伟等[5]应用单管巢式和半巢式PCR检测方法，实现了对MON89034转基因玉米及其产品的精准检测。经对该方法的研究可知，其在低含量转基因样品的检测中具有很大的优势，相对检测限达到了0.01%。

 

　　2.2 热不对称交错PCR

 

　　热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR）是染色体步移技术的一种。该技术利用不同的退火温度，通过将简并引物和3个嵌套的特异性引物分别组合并进行连续的PCR循环，选择性地对目标片段进行扩增，所获得的片段在探针标记和测序模板时可以直接使用。在分子生物学研究中，TAIL-PCR凭借其突出的特点成为了一种具有实用性的技术。此方法操作简单，反应灵敏，产物直接测序，快速获得目标片段，具有高度的特异性和敏感性，重复性也很好，无连接导致的假阳性。但是，整个检测过程需要一系列的连续反应，所以设置的反应条件应比较精细。

 

　　陈笑芸[6]通过热不对称PCR方法，以抗草甘膦转基因大豆为研究材料，采用多个通用引物平行扩增，并对其产物进行测序，最终获得了各转基因株系外源基因插入位点的序列信息，为以后的安全性评价提供了依据。RAO等[7]对转基因玉米BVLA430101的基因组进行TAIL-PCR、常规PCR检测，定义了3?侧翼序列。经验证表明，转基因玉米BVLA430101及其衍生产品的鉴定和量化可采用基于3?侧翼序列的定性和定量的PCR方法。

 

　　2.3 环介导温扩增法

 

　　环介导温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是通过对目标DNA链上的6个区域设计4种具有特异性的引物，在60～65℃恒温环境中，利用链置换DNA聚合酶的作用进行扩增，效率极高，完成109～1 010倍的扩增仅需15～60 min左右[8]。此技术是核酸扩增方法的全新升级，操作十分简单，所需要的设备简单且廉价，耗时极短。与PCR技术相比，LAMP技术在特异性、灵敏度以及检测范围等方面效果相当，甚至更好。

 

　　现在，已有许多研究者建立了转基因玉米、转基因甘蔗和转基因水稻等的LAMP技术检测体系，并实现了对样品的成功检测。ZHOU等[9]运用LAMP对转基因甘蔗中cry1Ac基因进行了检测，其结果最低检出限为1.0 ng/μL。随着LAMP技术的不断改善与成熟，许多研究人员将其他技术与其进行联合，开发了许多高效的检测方法。CHENG等[10]把DNA酶横向流动检测试纸条技术与LAMP相结合，对复合性状转基因大豆DP305423×GTS40-3-2进行了检测，结果表明该方法反应灵敏，特异性高。

 

　　2.4 微滴数字PCR技术

 

　　微滴数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR）是先对样品进行微滴化处理，也就是将预混合的含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳米级的微滴，使其形成油包水结构，以保证每个微滴中不含有或者含有少量的待检核酸靶分子。每个微滴的PCR扩增要在各自的反应体系中进行，添加的探针会使扩增的产物发出荧光信号，通过对微滴进行逐个检测，把产生信号的微滴判定为1，没有的则为0，从而实现定量的目的。如需对核酸靶分子进行绝对定量分析，根据阳性微滴个数与比例及泊松分布原理即可实现。

 

　　科研人员利用dd PCR技术对转基因玉米MON810进行了检测，并且检测出了玉米中外源基因的含量[11]。FU等[12]用对MON810等9种玉米品系进行dd PCR定量检测，获得的检出限为0.1%，这一结果低于欧盟规定的阈值。在低拷贝靶分子、细微模板浓度差异中，实时荧光定量PCR的灵敏度和精确度相对较差，而dd PCR不再依附Ct值，也就避免了这一缺陷[13]，所以dd PCR的进一步发展将成为定量检测的未来研究以及转基因食品检测的发展方向。

 

　　2.5 高效液相色谱法

 

　　高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）是以具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等为流动相，以连续高压的形式将其泵入装有固定相的色谱柱。待测混合物在柱内根据各成分在两相间的吸附能力、分配系数及离子交换能力等的差异进行分离，之后进入检测器进行检测，从而完成对试样的分析[14]。此技术灵敏度可达0.01 ng，分离效能高，分析所需时间短，应用广泛。但由于此技术存在“柱外效应”，所以需要进一步的改进。

 

　　李跃红[15]以转基因抗虫棉籽油为研究对象，采用高效液相色谱法测定了其中的维生素E含量，对其进行营养与卫生评价，获得了高准确率的试验结果。这一试验的数据将推动转基因抗虫棉籽油安全评估的进一步研究。曹柏营等[16]利用HPLC测定抗草甘膦转基因大豆、其亲本和常规大豆品种的酚类物质，试验结果为不同大豆材料都表现出了特定图谱。此实验可能将为转基因大豆的鉴定和安全评估研究开拓新的方向。

 

　　2.6 可视芯片技术

 

　　可视芯片根据所用探针种类的不同可以分为可视基因芯片和可视蛋白芯片。可视基因芯片的原理是在酶的催化作用下，目标分子和芯片表面的探针杂交，产生沉淀。在芯片表面沉积的沉淀，使芯片的厚度发生改变，从而改变了反射在芯片表面的光的波长，导致芯片的颜色发生变化，然后对结果进行判定。可视蛋白芯片的基因原理是通过蛋白质分子之间、蛋白质与核酸、蛋白质与其它分子之间的特异性结合，利用不同的标记手段（如纳米颗粒、磁珠等）使标记物产生指示作用，之后对检测结果进行判定[17]。

 

　　邓婷婷等[18]利用对实时荧光PCR和可视芯片技术的优化，以性状基因vip3a为靶标，建立了转基因玉米品系Mir162的特异性检测体系。根据研究发现，该技术灵敏度可以达到0.01%，其检测虽不需要特殊仪器，但仍能满足基础实验室在特异性和灵敏度等指标上对检测结果的要求。

 

　　2.7 液相芯片技术

 

　　液相芯片技术（liquid chip technology）又被称为灵活的多组分分析技术（x MAP）。它的核心是将微球用荧光染色进行编码，然后把针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子共价交联在每种编码微球上，之后把针对不同检测物的编码微球混合，再添加微量的待检样本，靶分子与微球表面交联的捕获分子在悬液中发生特异性结合，最后利用仪器的激光分别对微球的编码和检测微球报告分子的荧光强度进行识别[19]。液相芯片在对同一样本中的不同目的分子同时进行定性、定量分析时，仅仅需要少量样本就能完成。

 

　　FANTOZZI等[20]已相继针对转基因大豆的CAMVp35s和EPSPS基因序列以及转基因棉花复合品系表达的2种毒素构建了相应的液相芯片。FU等[21]对13种转基因玉米品系建立多重PCR-液相芯片检测方法，包括Mon810、Mon863及BT11等。结果显示，转基因玉米的探针和引物之间无非特异性杂交，特异性较高，多数转基因玉米品系的检测结果能够达到0.1%的灵敏度水平。这个试验结果满足了国内转基因监管执法和出入境检验的需求，并且在转基因产品标识上，符合欧盟和其他国家的要求。

 

　　2.8 试剂条法

 

　　“Cry 1 Ab/Cry 1 Ac快速检测试纸”——第一个提交检测结果并全部正确的参试检测试纸，是由中国农业科学院油料作物研究所研制的。它从40份不同水稻和玉米样品中检测出全部阳性盲样样品，仅需14 min且结果准确无误。2017年4月，依据“转基因试剂条快速检测技术操作规程”对不同品牌转基因快速检测试剂盒进行了比对试验，结果显示，试剂盒都对环境要求低，操作简单，灵敏度高，准确率高，检测速度快[22]。

 

　　用于转基因玉米蛋白快速检测的多功能试剂条经美国Enviro Logix公司的研制已经诞生。中科院生物技术研究所已研究出了一种名为金杯免疫检测的试剂条，它可以快速检测出植物样品中的BtCry1 Ab蛋白和Bt-Cry1 Ac蛋白[23]。目前，能同时检测多种复杂蛋白的测试纸已成为了各国的重点研究项目，这将为转基因食品快速检测技术的发展增添新的一笔。

 

　　3 结语

 

　　综上所述，近几年，进一步完善和发展的转基因食品检测技术已经迈入了新阶段。但一些技术仍存在一些难以避免的问题或仍有进步的空间，需要继续研究解决和提升。当然，希望开发更多快速检测的方法，能适用于基层及现场检测。总之，转基因食品检测技术将向着高效率，高灵敏度，高准确率，低费用，应用范围广，适应性强等趋势发展，使其能够检测现有的或新出现的各种转基因食品，提供更加准确可信的试验数据，推动转基因食品安全性评价的研究。

 

　　参考文献

 

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　　[5]闫伟,李葱葱,夏蔚,等.应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034[J].玉米科学, 2016, 24(4):56-60.

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