摘要：生物信息学作为一门新兴学科,在遗传病的筛查中具有广泛的应用。本文从背景、方法和实例等三个方面对生物信息学如何筛查遗传病进行介绍,为一线教师提供与遗传病筛查教学相关的基础背景信息。
关键词：生物信息学; 遗传病; 筛查;
Application of bioinformatics in genetic disease screening
Huang Jingyu Zhang Xiaoyi Yu Ruwang
生物信息学是一门由生物学和计算机科学等学科相互交叉而衍生而成的新兴学科。该学科主要应用于序列分析及生物芯片研究等领域,科研人员可利用生物信息学方法,使用计算机软件对生物数据进行分析研究。本文从背景、方法和实例三个方面介绍遗传病筛查的生物信息学方法,提供遗传病筛查的基础背景信息。
1 生物信息学筛查遗传病的背景
2018年12月,国家卫生健康委员会印发的《全国出生缺陷综合防治方案》中提到,我国出生缺陷总发生率约5.6%,基因突变等遗传因素和环境因素均可导致出生缺陷。由于日趋恶化的生活环境和不良的个体生活习惯导致遗传性疾病的患病率大大增加,而遗传病具有致病机理复杂的特点,目前主要采用的产前检测手段有遗传咨询、孕期超声检测、产前孕妇血清生化指标筛查及基因诊断等。遗传病的治疗周期长、效果差、费用高,病患往往迫于无奈选择中断治疗。因此,向大众普及遗传病知识,加大对遗传病筛查的宣传教育力度,广泛开展产前筛查,普及应用产前筛查的相关技术,对防治出生缺陷、提高人口素质、减轻家庭和社会负担都具有重大意义。
生物信息学包含了对生物信息的提取、处理、储存、分析和解释的各方面内容,并利用数学、信息学、生物学的方法来揭示数据所体现的生物学意义。伴随着基因组和蛋白质组数据库的完善,生物信息学技术在遗传病的致病机制及疾病筛查诊断等方面发挥越来越重要的作用。
2 生物信息学筛查遗传病的基本方法
2.1 高通量DNA测序技术
传统的DNA测序和其他的检测方法每次只能检测一种或少量的几种基因突变,耗时较长,若想完成对某些致病机理复杂的遗传病的筛查,则需要付出大量的时间和金钱。发展迅速的高通量DNA测序技术能够在较短的时间内,完成几十万到数百万DNA分子的序列测定。目前常用的高通量测序平台有罗氏公司的454测序仪、Illumina公司的Solexa基因组分析仪等,读取长度根据平台不同可从25碱基到450碱基[1]。高通量测序技术进行遗传病的筛查主要应用于无创产前诊断阶段。该技术首先提取孕妇外周血中的胎儿游离DNA,通过大通量的测序,结合生物信息数据分析,对胎儿染色体非整倍性以及由于染色体缺失、重复带来的疾病进行检测。
2.2 DNA芯片技术
DNA芯片技术主要步骤: ①将大量预先制备的DNA探针以显微打印的方式固定在硅片、玻璃片、瓷片等固体物质上制成DNA芯片;②将被标记的样品溶解后配制成适宜浓度的溶液,取适量加样在DNA芯片的表面,让样品与芯片上DNA根据碱基互补配对原则进行杂交;③杂交后经柠檬酸钠缓冲液(SSC)或SSPE缓冲液清洗,使用激光共聚焦荧光检测系统,扫描检测结合于芯片上基因的荧光信号,进行对照比较;④结合计算机系统,利用已有数据库信息对数据分析处理,即可得到所需的生物学信息[2]。DNA芯片的速度快、检测效率高且自动化程度更高,可应用于基因诊断、肿瘤筛查、细菌检测等诸多领域。下文提到的地中海贫血症的筛查正是利用了DNA芯片技术。
2.3 串联质谱技术
基因突变引起的代谢酶或蛋白质缺陷造成机体代谢紊乱,随之产生的遗传性代谢疾病种类繁多,临床症状表现也多样而复杂,且一旦发病,危害严重。若能够及时、快速地筛查出是否患遗传性代谢病,可减轻疾病造成的危害。20世纪90年代美国杜克大学儿科学教授David S. Millington提出可利用串联质谱(MS/MS)技术对新生儿疾病进行筛查,通过检测新生儿血液中各种氨基酸及酰基肉碱的浓度,诊断机体是否患有代谢异常(如氨基酸异常、脂肪酸异常、有机酸异常等)疾病。
串联质谱技术主要依靠两台质谱仪,第一台质谱仪是分离器,第二台质谱仪是分析仪。将被测物质分子电离成质荷比不同的带电粒子,在电磁作用下,这些带电粒子会相互分离,带有样品信息的离子按质荷比大小依次进入检测器,经分析后得到不同质荷比排列的离子质量谱。该技术灵敏性高、特异性强、通量高、检测速度快,只需要一份血液样本便可在几分钟内检测数十种代谢异常性疾病,应用价值大。
3 生物信息学筛查遗传病的实例
3.1 21-三体综合征筛查
21-三体综合征又称唐氏综合症,是我国常见的遗传病之一。与正常的胎儿相比,患儿的发育迟缓,自理能力受到限制,对患者家庭的经济和精神都造成了很大的压力。传统的染色体异常疾病检测手段是运用染色体核型分析,这种方法的检测时间长、可检测的疾病种类少。研究人员发现,可通过采集母体外周血提取胎儿游离的DNA进行高通量测序,再经过比对分析便可获得所要的生物信息。该技术能较准确地快速筛查出可能患病的胎儿。
具体筛查方法: ①提取孕妇外周血浆游离DNA片段进行高通量测序,片段化的基因组DNA两侧连上接头(adaptor),按Illumina平台操作要求进行PCR扩增,使其含量达到Illumina上机浓度要求;②将基因组DNA片段固定到透明的玻璃片(即Flow Cell)表面,DNA片段经过延伸和桥式扩增之后,在玻璃片表面上形成诸多单分子簇;③利用带荧光基因的四种dNTP和DNA聚合酶以及接头引物进行扩增,通过可逆性终止的边合成边测序(SBS)技术对待测的模板DNA进行测序。
在筛查操作过程中,当测序簇延伸互补链时,每加入一个带荧光基因的dNTP就能释放出对应的荧光。由于dNTP的3'—OH端经过化学修饰而失活,不能和其余的核苷酸反应,这样保证了每次只有一个核苷酸参与反应,提高测序的精确性。另外,每次合成DNA后,首先要洗去多余的dNTP和DNA聚合酶,扫描荧光标记得到此轮反应的荧光图像,然后去掉核苷酸上的发光组分,再通过化学修饰使3'端活化,参与到下一步的测序反应。多次反应后,收集荧光信号图像,统计并对结果进行数据分析[3]。
3.2 地中海贫血症筛查
地中海贫血症是一种由于人体内珠蛋白基因表达异常导致的遗传性血液病,也是世界上发病率最高的一种单基因遗传病。地中海贫血症在包括我国南方在内的东南亚地区、地中海地区、印度、中东地区、非洲北部等地发病率较高,且暂时没有治愈方法,只能通过遗传咨询和产前诊断提高优生率。珠蛋白基因突变的种类繁多,对地中海贫血症的筛查技术要求高,现有的诊断技术仍存在不足之处。应用DNA芯片检测技术检测地中海贫血症致病基因,耗时较短,可达到快速诊断的要求,对常见的基因类型能够准确诊断,操作简单,有较好的应用前景。
医务人员可按照试剂盒的建议及要求,提取孕妇外周血中的胎儿游离DNA。由于胎儿游离DNA含量很少,需要在含荧光标记引物的反应体系中进行PCR扩增,接着将PCR产物与杂交液进行混合,混合后的液体加到DNA芯片的点样区域,加盖玻片,放入杂交仓中。充分反应后,取出芯片洗涤、干燥。最后,根据DNA芯片厂商所提供的配套软件对杂交结果进行分析,寻找有表达差异或相似表达的基因,筛查诊断是否有致病的基因突变产生。除了上文所提到的DNA芯片之外,液相芯片技术也是筛查地中海贫血症的一种重要方法,广东省妇幼保健院医学遗传中心已成功设计出相应的探针,将探针分别与不同的荧光编码微球交联后,制备成用于检测的液相芯片系统。通过液相芯片检测仪读取杂交结果,获得胎儿是否患病的信息[4]。
3.3 苯丙酮尿症筛查
苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸代谢异常引起的隐性遗传病,其主要临床特征为智力发育不全,伴随有患儿排出带恶臭气味的尿和汗液,偶发癫痫等。若能及时诊断并采取积极有效的措施进行治疗,患儿智力可正常发育,减轻患者及患者家庭的经济、精神负担。苯丙酮尿症新生儿筛查的主要标记物是血液中苯丙氨酸含量,筛查方式多样,可通过Guthrie细菌抑制检测,也可采用化学荧光检测法等方法。目前,我国北京、上海及浙江等地已经开始采用准确率高、检测时间短的串联质谱(MS/MS)技术进行苯丙酮尿症的早期筛查。
苯丙酮尿症筛查最常采用的样品是血液,医护人员采血(新生儿足跟静脉血)后滴加在专用的采血滤纸片上,经干燥后备用。将滤纸片打成直径3 mm的圆形滤纸片放入孔板中,每个孔加入适量用苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)同位素标记的甲醇溶液,经过离心、静置处理后,取一个新的孔板重新上样并检测。最后,使用定量分析软件,根据Phe和Tyr同位素标记和离子峰强度及标准曲线,计算出新生儿血液中Phe和Tyr浓度。若Phe>120 mol/L,且Phe/Tyr>3.5,则可判定为苯丙酮尿症患儿[5]。
参考文献
[1] 周秉博,郝胜菊,闫有圣,等.高通量测序技术在常见遗传性疾病中的应用进展[J].中国优生与遗传杂志,2017(11):1-3.
[2] 张品品,王恺.DNA芯片技术及其应用[J].黄河水利职业技术学院学报,2011,23(1):52-54.
[3] CHIU RWK,CHAN KCA,GAO Y,et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma [J].Proceedings of the National Academy of the United States of America,2008,105(51):20458-20463.
[4] 秦丹卿,何天文,尹爱华.地中海贫血产前基因诊断技术的临床应用[J].分子诊断与治疗杂志,2017(4):223-227.
[5] CHRISTENSEN RD,HENRY E,WIEDMEIER SE,et al.Identifying patients,on the first day of life,at high-risk of developing parenteral nutrition-associated liver disease [J].Journal of Perinatology:Official Journal of the California Perinatal Association,2007,27(5):284-290.?
