随着酶负载量的增加，酶分子间形成空间位阻从而限制底物和产物之间的扩散， 影响酶催化活性， 研究固定化过程中酶的添加量也具有重要意义。 Wu 等[45]采用水热合成法合成
Fe3O4@rGO 纳米复合材料用以固定化 HRP, 用以进一步研究载体HRP 负载量和 HRP 初始加入量之间的数量关系 ,以及负载量增加对固定化 HRP 保留活性的影响。结果表明，HRP 负载量和 HRP 初始加入量呈线性关系，在 HRP 加入量为 25 mg·g-1时达到稳定；HRP负载量很低时， 固定化 HRP 可以保持 90%的高活性，但其会随着负载量的增大而降低直至达到平衡状态。 该载体最佳 HRP 负载量为 23.3 mg·g-1,固定化效率高达 91%, 在 10 次循环使用后仍保留 70%的初始活性。Jing 等[46]将已制备好的
Fe3O4@MCM-41结合到 GO 表面，并以 3-氯丙基三乙氧基硅烷（CPS）修 饰 GO 表 面 形 成 新 型 纳 米 复 合 材 料
CPS/GO-Fe3O4@MCM-41,用来共价固定 PPL（图 8）。 Fe3O4纳米粒子不仅可以通过外加磁场实现快速分离，更重要的是防止 GO 的集聚从而使材料表面区域和功能基团得以保留。 实验结果表明该复合材料的固定化效率和最大相对活性分别达到 98%和 97.9%. 固定化酶在 30 ℃下保存 56 d 仍可保留 85%的活性，远高于游离酶的 19%,10 次循环使用后的保留活性仍高达 87%,表明该 GO 复合材料在提高稳定性和可重用性方面具有重要作用。 值得一提的是，该法中酶和支持材料之间几乎不存在空间位阻，这大大提高了催化效率。
2.1.2 有机聚合物-石墨烯纳米复合材料固定化酶。
聚合离子液体（PILs）兼具离子液体和聚合物两者优点，如良好的电导性、热稳定性和机械强度等，PILs 在合成各种纳米材料中是非常有效的稳定剂或改性剂。 近年来，利用聚合离子液体修饰石墨烯表面改善其在水溶剂中的可分散性和溶解性成为一种行之有效的方法[47]. Li 等[48]首先用 NaBH4预处理 GO 表面得到 rGO,再通过原位聚合法，通过合成聚 合 离 子 液 体 1-乙 烯 基-3-丁 基 咪 唑 溴 化 物（ViBuIm+Br-）形成纳米复合材料 poly（ViBuIm+Br-）@GO, 通 过 静 电 作 用 将 GOx 固 定 在 其 表 面 ,poly（ViBuIm+Br-）不仅改善了载体的疏水性，且在水溶液中可提供正电荷以进一步在温和条件下实现酶的固定化。
壳聚糖（CS）是一种天然多糖，具有多种官能团，无毒性，拥有良好的吸附性能、生物相容性和生物降解能力， 但其机械强度差的缺点一直限制其应用。 将 GO 和 CS 通过共价连接制备
GO@CS 复合材料可以较好地解决上述缺点。 Li 等[49]首先通过Hummers 法制备 GO, 再使用 EDC /NHS 为缩合剂将 CS 共价连接到 GO,FeCl3·6H2O 和 1,6-己二胺通过溶剂热反应在其表面生成 Fe3O4纳米粒子从而得到复合材料
CS-GO@Fe3O4（图 9），并通过载体静电吸附（Ⅰ法）、以 GA 做交联剂共价结合（Ⅱ法）、以亚氨基二乙酸（IDA）和 Cu2+修饰载体通过金属螯合作用（Ⅲ法） 固定化 CAL,3 种固定化方法都提高了 CAL对 pH 值和温度的耐受性， 最适温度范围从游离酶的 45~50 ℃， 拓宽到 45~65 ℃， 且在 75 ℃下仍可保留 75%的活性； Ⅱ法在重复使用性上表现最为优异， 且 10 次循环使用后仍可保留 70%的保留活性。
