孢子固定化酶技术的生物学原理及实例分析(3)

　　2. 2. 3 壳聚糖层的形成。
　　
　　β-葡聚糖层组装完成后，孢子进行壳聚糖（ 脱乙酰几丁质） 层的合成。壳聚糖聚合物的自组装与 β-葡聚糖类似，首先几丁质合酶 CSⅢ催化亚基 Chs3p将几丁质（ β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖单体） 两两结合形成聚合物，输送至孢子质膜外； 此时存在于孢子壁中的特异性脱乙酰酶 Cda1p 和 Cda2p 将其脱乙酰化，形成壳聚糖（ β-1,4-氨基葡萄糖）[41 -43].营养细胞中变构调节蛋白 Chs4p 作为几丁质合酶的正向调控蛋白，在产孢过程中其功能被同源的 Shc1 所取代[44].一旦壳聚糖聚合物形成，则被精确定位到孢子壁中，定位相关基因至少包括 MUM3 和 OSW1;Mum3 蛋白与酰基转移酶同源，这可能与孢子壁组装的催化机制一致[45],然而 Mum3 蛋白的功能尚不明确； Osw1 蛋白定位在孢子壁中，并可能直接参与壳聚糖层的组装[36,39].同时由于壳聚糖在包裹孢子的过程中形成分支后与相邻孢子的壳聚糖连接，因此在壳聚糖层形成的过程中，孢子桥连形成[32]; 即使将子囊膜去除，由于这种桥连的存在，4 个孢子仍然连接在一起。
　　
　　2. 2. 4 二酪氨酸层的形成。
　　
　　该层既不是由糖类组成，也不是由蛋白质组成，而是由含量大约为 50% 的非肽类 N,N-二甲酰基二酪氨酸组成[46 -47]; 然而其他成分以及二酪氨酸单体如何定位在孢子壁上仍然未知。该层的形成分为两步： 首先是二酪氨酸的形成，其次是二酪氨酸的转运及定位。位于孢子基质中的 DIT1 和 DIT2 基因参与二酪氨酸的形成[48].首先具有甲酰基转移酶活性的Dit1p,将甲基转移至 L-酪氨酸上； 作为细胞色素 P450家族成员的 Dit2p 将 2 个 N-甲基-酪氨酸的苯环连接在一起[48]形成二酪氨酸。新合成的二酪氨酸在 ATP依赖的、位于前孢子膜上的转运蛋白 Dtr1p 的作用下由孢子胞质运送至孢子壁进行组装[49].像前几层的合成一样，二酪氨酸需要在胞外酶的作用下组装为聚合体的形式，但是对这些酶的具体功能还有待研究。
　　
　　形成的二酪氨酸层网状孔径大小、松散程度可以通过某些基因的突变进行调节，如 OSW2 基因的敲除，使得二酪氨酸层孔径增大。对于缺失了二酪氨酸层的 dit1Δ 孢子和同时缺失了二酪氨酸层与壳聚糖层的 chs3Δ 孢子，可溶性蛋白则渗漏到孢子壁外部的子囊胞质中[19].以上突变，对孢子固定化酶酶学性质改进提供了物质基础。
　　
　　3 酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶实例。
　　
　　根据不同的实验要求，本研究室已利用酵母孢子固定化酶技术成功地固定了多种可溶性酶，下面的实例中将分别予以介绍。
　　
　　3. 1 酵母孢子固定化酶的成功先例---酿酒酵母孢子微胶囊固定化 α-半乳糖苷酶。
　　
　　施李兵等[10]为了研究二酪氨酸层对于 α-半乳糖苷酶的固定是否必需及其在孢子中的定位情况，将α-半乳糖苷酶（ MEL1 基因编码） 与红色荧光蛋白RFP 在孢子中进行融合表达。在此之前，研究者首先将 RFP 连接在信号肽 C 端构建 spRFP 融合蛋白，并在不同孢子突变体上进行表达（ 孢子固定化酶生物法） : 酿酒酵母野生型孢子（ 孢子壁完整） 、osw2Δ 孢子（ 二酪氨酸层疏松） 和 dit1Δ 孢子（ 不含有二酪氨酸层） .通过荧光共定位发现： 野生型孢子由于二酪氨酸层的存在，在孢子壁边缘有清晰的红色荧光轮廓；osw2Δ 孢子的二酪氨酸层虽然有一定程度的缺陷，但孢子壁周围仍具有较强的清晰红色荧光； dit1Δ 缺陷型孢子由于不含有二酪氨酸层，RFP 不能被固定在孢子壁上，因此弥散在子囊胞质中，从而证实二酪氨酸层能够作为“扩散屏障”阻止可溶性蛋白的扩散。
　　
　　随后，研究者为了证明壳聚糖层在孢子固定化α-半乳糖苷酶中的作用，将 α-半乳糖苷酶与 RFP 在孢子中进行融合表达。与单独表达 RFP 的结果一致，野生型孢子和 osw2Δ 孢子均能够将融合蛋白表达定位在孢子壁上； 但值得注意的是，与单独表达 RFP不同，dit1Δ 孢子表达的 α-半乳糖苷酶-RFP 融合蛋白也能够定位在孢子壁上； 而 chs3Δ 孢子（ 不含有二酪氨酸层和壳聚糖层） 表达的融合蛋白不能表达定位在孢子壁上。说明对于 α-半乳糖苷酶，不需要二酪氨酸层的存在，壳聚糖层就可以将该酶表达定位在孢子壁上。
　　
　　研究者为了确定最优的表达固定体系，对不同突变株固定的 α-半乳糖苷酶的活性进行检测。同野生型孢子和 osw2Δ 孢子相比，dit1Δ 孢子表达的 α-半乳糖苷酶的活性最高，可能的原因是由于“扩散屏障”二酪氨酸层的缺失，使得底物更易于与酶接触发生反应； osw2Δ 孢子表达的 α-半乳糖苷酶的活性比野生型高，可能的原因是 osw2Δ 孢子的二酪氨酸层较野生型松散、孔径更大，底物更容易穿过二酪氨酸层与酶接触发生反应。
　　
　　虽然 dit1Δ 孢子表达的 α-半乳糖苷酶的活性最高，但由于“扩散屏障”二酪氨酸层的缺失，导致dit1Δ 孢子表达固定的 α-半乳糖苷酶更易释放。为了验证这种可能性，对各种突变体孢子用含有去污剂的高盐溶液（ 0. 6 mol/L NaCl 和 0. 1% Triton X-100）进行洗涤，然后测定洗涤后的活性。结果显示： 同野生型孢子和 osw2Δ 孢子相比，dit1Δ 孢子表达的酶活下降得最为明显； 又经过 4 次洗涤，dit1Δ 孢子表达的酶活下降了约 50%,wt 孢子和 osw2Δ 孢子表达的酶活下降了约 25%.由此可以说明，二酪氨酸层的存在对于阻止 α-半乳糖苷酶从孢子壁上的释放起到重要作用。
　　
　　为了研究孢子固定化 α-半乳糖苷酶对蛋白酶的抗逆性，使用蛋白酶 K 对不同孢子壁缺陷型孢子固定化 α-半乳糖苷酶进行处理，并以酿酒酵母营养细胞分泌到培养基中并浓缩的 α-半乳糖苷酶作为对照。结果显示： 野生型孢子和 osw2Δ 孢子固定的 α-半乳糖苷酶对蛋白酶 K 展现出很强的抗逆性。这是由于： 二酪氨酸层作为“扩散屏障”只能允许小分子物质（ 如底物和产物） 通过，不允许大分子物质（ 如蛋白酶 K、固定在孢子壁中的酶） 通过。蛋白酶 K 与 α-半乳糖苷酶隔离，从而展现出抗蛋白酶 K 降解的能力； dit1Δ 孢子固定的 α-半乳糖苷酶经蛋白酶 K 处理后，虽然酶活下降较野生型和 osw2Δ 多，但仍有很高的相对酶活，说明壳聚糖层对 α-半乳糖苷酶也有一定的保护作用； 而游离的 α-半乳糖苷酶由于不受到任何保护作用，经蛋白酶 K 处理后，相对酶活仅为35% 左右。此外还发现孢子固定的 α-半乳糖苷酶具有比游离酶具有更高的温度耐受性； 同时，经多次洗涤后，孢子固定化酶残留酶活仍然很高。
　　
　　3. 2 酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶在稀少糖合成中的应用。
　　
　　以葡萄糖为底物，在木糖异构酶（ XI） 和 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（ DPE） 的联合作用下合成具有广泛应用前景的 D-阿洛酮糖（ Psicose） 是目前稀少糖研究的重点。为避免直接使用游离酶，本研究室李子杰和李毅[12]利用生物法和化学法两种方法对木糖异构酶和 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行了孢子固定化。在生物法的研究中，将 XI 与 GFP 在孢子中进行融合表达，通过 GFP 的荧光定位来确定 XI 在孢子中的定位。对于野生型孢子和 osw2Δ 孢子，能够清晰地看到GFP 绿色荧光信号完好地包裹在孢子壁上，说明 XI成功地固定在了孢子壁上。相对于野生型孢子和osw2Δ 孢子，dit1Δ 孢子由于二酪氨酸层的缺失导致GFP 信号强度稍弱，但仍可以观察到融合蛋白表达定位到孢子壁上。为了确定 XI 在孢子上是否具有催化活性，通过 HPLC 检测固定化 XI 将 D-葡萄糖转化为D-果糖的能力。结果显示，底物 D-葡萄糖在孢子固定化酶的催化作用下可以转化为 D-果糖。之后对不同孢子壁缺陷型孢子固定化 XI 进行了酶活比较、重复利用率、最适温度和最适 pH 等实验，结果与施李兵研究相似，osw2Δ 孢子是较野生型和 dit1Δ 孢子最适合用于固定化酶的载体。值得注意的是，野生型和osw2Δ 孢子固定化酶在 95℃ 高温下的相对酶活都能达到最高酶活的 60%.综合考虑，孢子壁中二酪氨酸层的存在，一方面能有效地阻止酶的释放，另一方面提高了酶对高温的耐受性。