1. 4 miRNA 的功能 miRNA 通常位于基因间隔区，但也有部分存在于遗传编码基因的内含子中[11].它虽仅占人类基因总数的 2%,却调控着人类基因组中 30%以上的基因，是基因调控网络中的核心成分[12].miRNA 在生物体内广泛存在，对包括生物体的细胞增殖、分化、凋亡和生物体个体的发育以及疾病的产生、进展及预后等生命活动均发挥着广泛的生物学调控作用，故而对其进行深入研究具有非常重要的意义[13-14].当今，miRNA 已 成 为 肿 瘤 研 究 领 域 中 的 热 点。Calin 等[15]于 2002 年最先报道了 miRNA 在肿瘤发生中的作用。随着研究的不断深入，人们发现基因组的不稳定性是肿瘤的常见特征之一，约 50% 的 miRNA 基因位于与肿瘤相关的染色体的脆性位点上，而且不同类型的肿瘤具有明显不同的 miRNA 表达谱[16].miRNA 具有类似癌基因或抑癌基因的功能，表现为癌基因的活化或抑癌基因的失活，如 Let-7、miR-15、miR-16、miR-34a / b / c、miR-124、miR-143、miR-145、miR-122a 等在多种肿瘤中相继被证实发挥类似抑癌基因的作用[17-22],而 miR-21、miR-10b、miR-221 和 miR-222 等在多种肿瘤中扮演着类似癌基因的角色[23-26].
1. 5 miRNA 的靶基因预测 由于 miRNA 的功能与其所调控的靶基因密切相关，所以研究 miRNA 的功能必将涉及对miRNA 靶基因的鉴定。但是，miRNA 对靶基因的调节通常并不是一一对应的，大多数情况下，一个 miRNA 同时对多个靶基因发挥调控作用，而一个基因也同时被多个 miRNA 所调控； 况且生物体具有非常复杂的内在机制，miRNA 的表达调控并不是孤立存在的，miRNA 对基因的调节存在着多种调控机制和作用模式，所以，鉴定 miRNA 靶基因既是这一研究领域的重点，也是该研究领域的难点。生物信息学的飞速发展使科学家们能够使用特殊的软件和数据库来预测 miRNA 的靶基因[27].生物信息学方法主要是基于 miRNA 和靶基因间的相互作用具有一定的规律性，通过建立计算模型，整合已有的生物学数据，应用某种算法或程序来预测 miRNA 的靶基因。目前 常 规 的 算 法 和 程 序 一 般 遵 循 以 下 几 条 规 律：
①miRNA 靶位点在不同物种之间具有保守性； ②miRNA 与靶基因之间具有互补性； ③miRNA 与信使 RNA 相互之间具有热稳定性； ④miRNA5' 端的结合能力比 3' 端的结合能力强[28].除了以上这些基本规则外，不同的算法和程序还会根据各自总结的规律进行改进和优化。生物信息学预测方法的应用前景广阔，使寻找 miRNA 靶基因有律可循，但是这种方法得出的结果假阳性率很高； 并且运用生物信息学预测的miRNA 与信使 RNA 相互作用只是一种理论上的结合，在不同条件下，miRNA 究竟以何种作用形式以及水平存在并不能通过生物信息学预测。常用的 miRNA 靶基因预测网站主要包括，①TargetScan: 科学家在 2003 年开发的一款用于预测哺乳动物 miRNA 靶基因的软件，它主要是基于 miRNA 与信使RNA 的碱基互补配对原则，利用 miRNA 结构序列上的保守性和信使 RNA 与 miRNA 相互之间的热力学稳定性，来预测miRNA 靶目标，它为人们提供网络实时服务，是目前使用频率最高的 miRNA 靶基因预测软件； ②miRbase: 该软件可以通过名称、关键词或序列等方式进行检索，并可通过链接查询有关该 miRNA 的主要文献，对 miRNA 进行基因组背景分析及靶标预测等； ③miRanda: 是第一个利用生物信息学对 miRNA靶基因进行预测的软件，于 2003 年开发设计，应用范围广，但假阳性率较高； ④PicTar: 是研究人员通过特定的计算法则来预测脊椎动物、线虫、果蝇和人类的非保守但共表达的miRNA的靶基因，并通过实验方法进行验证。
1. 6 miRNA 的靶基因验证 虽然运用生物信息学的方法可以为研究人员提供大量的信息，且相对简单、快速，但是，它只是通过理论上的某种计算为研究人员提供某些参考信息，存在一定的局限性和可靠性，还需要通过生物实验方法进行验证。最直接的验证方法是，运用荧光定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法检测转染 miRNA 后的细胞（ 组织） 中信使 RNA 水平及蛋白水平，从而明确 miRNA 与靶基因的对应关系。近年来发展快速的荧光素酶报告基因法由于其快速、灵敏度高以及检测范围广，可以直接验证 miRNA 的靶位点。
1. 7 miRNA 的检测 目前已有多种方法检测 miRNA,包括基因克隆、Northern blotting、原位杂交、反转录聚合酶链反应、微阵列芯片及高通量测序等技术。目前，大多数 miRNA 是通过反转录克隆识别和鉴定出来的，这是人们发现 miRNA 的一个重要方法； Northern blotting 是最为经典的检测 RNA 的手段，也是目前检测 miRNA 表达水平的最主要方法，所有通过克隆和生物信息学分析得来的 miRNA 都应该经过 Northernblotting 来验证和鉴定； 原位杂交是了解 miRNA 时间和组织特异性表达最常用的方法； 反转录聚合酶链反应是一种可以定量分析 miRNA 表达水平的方式，也可用于验证生物学预测的 miRNA; 芯片技术的应用实现了在全基因组水平鉴定成熟miRNA 的表达，分析同一细胞中不同的 miRNA 的差异性表达以及比较不同组织或细胞中 miRNAs 表达谱的差异，成为高通量检测的最佳选择； 高通量测序能够在实验中发现新的小分子 RNA,成功地检测到了基因芯片未发现的 miRNA[29].
2 miRNA 的应用
由于 miRNA 在生命活动中表现出来的广泛调节功能以及对基因表达、生长发育和疾病发生、发展等的复杂效应，miRNA 自被发现以来即成为生命科学的研究热点。生命科学研究已经进入后基因组时代，利用 miRNA 从分子水平来阐明生物体的生命活动过程，阐述物种的起源和生物的演化，来揭示生命的奥秘。基因表达具有时间和空间的特异性，不同物种、组织、细胞，在不同生理、病理状态下 miRNA的表达情况不同，它们可能会成为用于诊断和（ 或） 区分健康与疾病状态的潜在生物标志物[30].目前，miRNA 已经作为多种疾病的生物标志物[31-33].此外，理论上，通过改变miRNA 的空间结构，可以发现潜在的药物作用靶点； 抑或采用 miRNA 模拟物、miRNA 激动剂、miRNA 抑制物以增加或降低病变组织或细胞的 miRNA 水平，从而下调或上调特异性靶蛋白的表达，开展基于 miRNA 的分子靶向治疗及个体化治疗方案[34].
3 小 结
在过去的研究中，人们已经了解了很多关于 miRNA 的特性及功能的知识，但对 miRNA 具有的所有特性和功能还缺乏全面的研究； 而 miRNA 在生物体整体分子网络中扮演的角色的研究才刚刚开始。在未来的研究中，人们将会运用系统生物学方法来研究 miRNA 参与控制生物体的生长发育以及生物体在不同状态下的表达水平，对生物体的生命机制进行全面而系统地分析。相信随着研究的不断深入，这些研究成果必将会造福于人类。
参考文献
[1] Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V. The C. elegans heterochronicgene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity tolin-14[J]. Cell,1993,75（ 5） : 843-854.
[2] Reinhart BJ,Slack FJ,Basson M,et al. The 21-nucleotide let-7 RNAregulates developmental timing in Caenorhabditis elegans [J].Nature,2000,403（ 6772） : 901-906.
[3] Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,et al. Identification ofnovel genes coding for small expressed RNAs[J]. Science,2001,294（ 5543） : 853-858.
[4] Griffiths-Jones S,Hui JH,Marco A,et al. MicroRNA evolution byarm switching[J]. EMBO Rep,2011,12（ 2） : 172-177.
[5] Yang JS,Phillips MD,Betel D,et al. Widespread regulatory activityof vertebrate microRNA* species[J]. RNA,2011,17（ 2） : 312-326.
[6] Brameier M. Genome-wide comparative analysis of microRNAs inthree non-human primates[J]. BMC Res Notes,2010,3: 64.
[7] Sonntag KC,Woo TU,Krichevsky AM. Converging miRNAfunctions in diverse brain disorders: a case for miR-124 and miR-126[J]. Exp Neurol,2012,235（ 2） : 427-435.
[8] Swartling FJ,Bolin S,Phillips JJ,et al. Signals that regulate theoncogenic fate of neural stem cells and progenitors[J]. Exp Neu-rol,2014,260: 56-68.
