2.2 Rab29调控逆膜转运通路 野生型的3Flag-Rab29与MPR有着相似的细胞内分布，均是核周聚集状，并且有着大量的共定位。不论3Flag-Rab29T21N还是3Flag-Rab29Q67L的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状。这两种Rab29的突变也导致了MPR的细胞内定位发生了改变，即由核周变为弥散，表明Rab29参与调控逆膜转运通路。
2.3 Rab29调控PTHR的胞内分布 PTH（1-34）刺激后的PTHR内吞至细胞内呈现出核周聚集的分布，并且与野生型Rab29大量共定位，由于Rab29定位于反式高尔基体，可以将Rab29看成高尔基体的标志物，所以这表明了内吞进细胞内的PTHR回到了高尔基体。对照组中PTHR的降解速率较缓慢，在6h处，仍有大于60%的PTHR未被降解。当Rab29被敲减掉之后，PTHR的降解速率显着加快，在6h处，PTHR只剩不到40%未被降解。蛋白免疫印迹（Western blot）的灰度分析强有力得证明了Rab29的缺陷导致了PTHR的稳定性下降，降解加速。见图1.
3讨论。
为确定Rab29在细胞内的定位，本研究首先探究了Rab29在细胞器上的分布情况。研究证明Rab家族的蛋白参与了囊泡出芽和融合这些膜转运过程[7,10],因此本研究首先将视野放到Rab29与高尔基体，内体这2个经典膜转运细胞器的关联上。本研究证实了Rab29定位于高尔基体。由于高尔基体由顺式高尔基体（cis-Golgi）和反式高尔基体（trans-Golgi）组成，这两部分在蛋白质的修饰和转运中有这不同的作用。同时，本研究同样使用免疫荧光技术证实了Rab29定位于反式高尔基体。
本研究中使用免疫荧光技术标记MPR与3种Rab29.野生型的3Flag-Rab29与MPR有着相似的细胞内分布，均是核周聚集状，并且有着大量的共定位。不论3Flag-Rab29T21N还是3Flag-Rab29Q67L的细胞内定位均由野生型的核周聚集变为细胞内弥散状。本研究Rab29的突变也导致了MPR的细胞内定位发生了改变，即由核周变为弥散。推测这种改变的原因是Rab29的突变导致了逆膜转运通路受损，MPR不能经由逆膜转运通路从溶酶体回到高尔基体，从而弥散在了细胞内。持续激活型的Rab29Q67L表现出了与无功能型Rab29T21N对MPR相似的影响。其原因可能是Rab29Q67L虽然持续结合ATP,成为激活形式，但是Rab29Q67结合ATP后又迅速将ATP水解掉，所以也表现为无功能型突变形式。
本研究证实了定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，并且Rab29调控了PTHR的胞内转运。这于先前的关于逆膜转运体retromer终结PTHR的cAMP的实验相符合，只有当逆膜转运体retromer将PTHR转运至 高 尔 基 体 时，信 号 转 导 才 被 终 止[7,11].Rab29调 控PTHR的意义不仅在于保证PTHR顺利到达高尔基体重新回到细胞膜表面，还在于Rab29增加了PTHR在细胞内的稳定性，阻止了PTHR被溶酶体迅速降解[12].
综上所述，定位于反式高尔基体的Rab29是逆膜转运通路中不可或缺的一部分，对PTHR的胞内转运起着重要的调控作用。继续探究逆膜转运以及PTHR的转运机制，可以丰富对于受体转运的了解，为转运机制缺陷而导致的受体调控骨代谢障碍的疾病找到新的治疗靶点具有重要的临床和科研价值。
参考文献：
[1]Bellido T,Saini V,Pajevic PD.Effects of PTH on osteo-cyte function[J].Bone,2013,54（2）：250-257.
[2]Kang DS,Tian X,Benovic JL.Arrestins and G Protein-Coupled Receptor Trafficking[J].Handb Exp Pharma-col,2014,512（219）：173-186.
[3]Vilardaga JP,Romero G,Friedman PA,et al.Molecularbasis of parathyroid hormone receptor signaling and traf-ficking:a family B GPCR paradigm[J].Cell Mol Life Sci,2011,68（1）：1-13.
[4]Feinstein TN,Wehbi VL,Ardura JA,et al.Retromer ter-minates the generation of cAMP by internalized PTH re-ceptors[J].Nat Chem Biol,2011,7（5）：278-284.
[5]Mitra S,Cheng KW,Mills GB.Rab GTPases implicated ininherited and acquired disorders[J].Semin Cell Dev Biol,2011,22（1）：57-68.
[6]Wang S,Ma Z,Xu X,et al.A role of Rab29in the integri-ty of the trans-Golgi network and retrograde trafficking ofmannose-6-phosphate receptor[J].PLoS One,2014,9（5）：e96242.
[7]Pfeffer SR.Rab GTPase regulation of membrane identity[J].Curr Opin Cell Biol,2013,25（4）：414-419.
[8]Arighi CN,Hartnell LM,Aguilar RC, et al.Role of the mammalian retromer in sorting of thecation-independent mannose 6-phosphate receptor[J].JCell Biol,2004,165（1）：123-133.
[9]Seaman MN.Cargo-selective endosomal sorting for re-trieval to the Golgi requires retromer[J].J Cell Biol,2004,165（1）：111-122.
[10]Onnis A,Finetti F,Patrussi L,et al.The small GTPaseRab29is a common regulator of immune synapse assem-bly and ciliogenesis[J].Cell Death Differ,2015,22（10）：1687-1699.
[11]Attar N,Cullen PJ.The retromer complex[J].Adv En-zyme Regul,2010,50（1）：216-236.
[12]Shenoy SK,Barak LS,Xiao K,et al.Ubiquitination of be-ta-arrestin links seven-transmembrane receptor endocyto-sis and ERK activation[J].J Biol Chem,2007,282（40）：29549-29562.
