摘要：数字PCR（Digital PCR,dPCR）是核酸绝对定量的新方法，该技术通过分液，将含有核酸模板的PCR反应体系分配到上万个反应器中进行PCR扩增，根据荧光信号的有或无，进行结果计数，通过泊松分布的统计处理，直接得出核酸的拷贝数。相比于实时荧光定量PCR（Quantitative PCR,qPCR），dPCR不需要建立标准曲线，应用前景更广。本文对dPCR的发展历史、原理及其应用进行了综述。
关键词：数字PCR;绝对定量；拷贝数；实时荧光定量PCR.
自1985年Kary Mullis发明PCR技术以来，PCR技术一直是生物医学领域中重要的实验方法。随着分子生物学技术的发展，目前核酸定量的主要方法 是 实 时 荧 光 定 量PCR（Quantitative PCR,qPCR）。数字PCR（Digital PCR,dPCR）是近年来发展起来的新技术，是对传统PCR方法的技术革新，两者最主要的区别在于计算核酸拷贝数方法不同，dPCR方法采用了新的定量策略和实验思路，可以对核酸的拷贝数进行绝对定量，相比于qPCR不需要建立标准曲线，具有更广阔的应用前景。目前，已有很多基于微滴或芯片的商业化dPCR平台应用于分子生物学、医学等各个领域，并发挥了重要作用。因此，本文主要从dPCR方法的发展历史、原理及其应用方面进行了阐述。
1 dPCR的发展历史。
1992年，Sykes等[1]从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞，检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则：有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理，为以后dPCR的发展奠定了基础。
1997年，有研究利用玻璃毛细管作为载体进行PCR反应，可以对模板分子进行定量，验证了Taq-Man探针可以检测模板单分子，尤其在微小的反应体系中，发展了单分子定量技术[2],为dPCR单模板扩增提供了技术支持。
1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W.Kin-zler[3]正式提出了dPCR的概念，可以将指数型函数转化成线性函数，对模板进行有限稀释，根据荧光信号的有或无进行精确定量。实验利用384孔板对样品进行稀释、扩增，来检测结、直肠癌粪便样品中c-Ki-Ras基因突变，对数据进行泊松分布的处理。研究还提出了数字PCR的另外一个优势，由于粪便样本中含有大量的PCR反应抑制剂，通过对样品进行稀释，提高了对反应抑制剂的耐受程度。
2003年，Devin等[4]提出了BEAMing技术，包括小珠（Bead）、乳浊液（Emulsion）、扩增（Amplifi-cation）、磁性（Magnetic）。利用包被链霉亲和素的磁性珠子和生物素标记的寡核苷酸，形成微乳液，进行PCR扩增，通过流式细胞仪检测荧光标记来进行计数，这个技术为以后微滴式dPCR的产生提供了技术依据。
2006年，Fluidigm公司第一个生产商业化的基于芯片的dPCR仪，主要包括EP1系统和BioMarkHD系统。2009年，Life Technologies推出了OpenArray和QuantStudio 12K Flex dPCR系统，2013年，Life Technologies又 推 出 了QuantStudio 3DdPCR系统，采用高密度的纳升流控芯片技术，将样本均匀的分配至20 000个单独的反应孔中。
2011年，Bio-Rad公 司 推 出 了 基 于 微 滴 的QX100dPCR仪，利用油包水技术，将样品平均分配到20 000个微滴油包水中，利用微滴分析仪对微滴进行分析；2013年，Bio-Rad公司推出在QX100基础上的升级QX200dPCR仪。2012年RainDance公司推出了RainDrop dPCR仪，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1 000万个皮升级别微滴的反应乳液，提高了dPCR仪的检测范围，适于检测浓度差异较大的样品（表1）。
到目前为止，dPCR的扩增载体从多孔板、毛细管发展到目前的芯片和微滴，降低了反应成本，提高了PCR反应的分液数目和实验的灵敏度。
2 dPCR的原理。
dPCR的原理是将含有核酸模板的标准PCR反应体系，平均分配成上万个和数百万个PCR反应，分配到芯片或微滴中，使每个反应中尽可能含有一个模板分子，进行单分子模板PCR反应，通过读取荧光信号的有或无进行计数，经过统计学泊松分布的校准进行绝对定量。
