机体发生一系列非遗传的、可逆的代偿性变化以适应高原低压、低氧环境的过程称为高原习服。对于初次进入高原的人群而言，能量产生和利用的平衡是机体顺利适应高原环境的关键。通常高原暴露时间≤2周称为急性高原暴露期，>2 周称为慢性高原暴露期。
人和动物实验表明，在急性高原暴露期，心肌、骨骼肌对葡萄糖的摄取增加，高糖饮食有利于机体尽快适应高原环境[1 -3].可见，糖代谢在高原习服过程中具有重要作用。在饥饿、低氧等特殊环境中，机体会通过增加糖异生以保证组织供能。但是，急性或慢性高原暴露情况下机体糖异生过程的变化在国内外少有报道。肝脏是糖异生的主要场所，通过研究肝脏糖异生变化可以间接了解高原环境对机体糖代谢的影响。
葡萄糖 - 6 - 磷酸酶 （ glucose - 6 - phosphatase,G6pase） 是糖异生的关键酶，催化水解 6 - 磷酸葡萄糖生成葡萄糖，转录因子叉头框蛋白 O1 （ forkheadboxO1,FoxO1） 是重要的肝脏糖异生调节因子，腺苷酸活化蛋白激酶（ adenosine monophosphate actived pro-tein kinase,AMPK） 在糖代谢和脂代谢中都具有调节作用。本研究通过观察大鼠在海拔 4300 m 高原暴露1、3、7、15、30 d 时肝脏中 G6Pase、FoxO1 和肝糖原含量的变化并结合本课题组的前期研究 AMPK[4]的变化，以了解高原环境对肝脏糖异生的影响及调节机制。
1 材料和方法
1. 1 实验动物及分组 健康成年 SPF 级雄性 SD 大鼠 36 只（ 体质量为 220 ~ 300 g） ,购自西安交通大学医学动物实验中心。将实验动物随机分为 6 组，每组6 只： 平原对照组（ C 组） ,在平原动物房内饲养（ 海拔400 m） ; 高原暴露 1 d 组 （ H1） 、3 d 组 （ H3） 、7 d 组（ H7） 、15 d 组（ H15） 、30 d 组（ H30） ,分别在海拔4300 m 的高原动物房内饲养 1、3、7、15、30 d.动物房温度（ 22 ±1） ℃，常规大鼠饲料，自由进食摄水，光照约 10 h/d.
1. 2 方法
1. 2. 1 组织取材及处理 饲养到规定时间，禁食不禁水 12 h,将大鼠麻醉后处死。心脏采血 2 ml,分离血浆，-20 ℃保存备用。迅速分离肝组织，立即置于液氮保存，随后移至 -80 ℃保存。
1. 2. 2 RT - PCR 方法检测肝脏 G6Pase、FoxO1 mR-NA 表达 （ 1） 采用 TRIzol 一步法提取肝脏总 RNA,测定其纯度及浓度。设计并合成 RT - PCR 引物：G6Pase 上游引物： 5' - AACGTCTGTCTGTCCCGGATC-TA - 3',下游引物： 5' - CCTCTGGAGGCTGGCATTGTA-3',扩增长度为 132 bp; FoxO1 上游引物： 5' - CCTACT-TCAAGGATAAGGGCGACA - 3',下游引物： 5' - CTGGAT-TGAGCATCCACCAAGA - 3',扩增长度为 141 bp; β -Actin 上游引物： 5' - CATCCGTAAAGACCTCTATGC-CAAC - 3',下游引物： 5' - ATGGAGCCACCGATCCA-CA - 3',扩增长度为 97 bp.（ 2） 反转录条件为 37 ℃15 min,85 ℃ 5 s,分装反转录后的 cDNA,于 - 80 ℃保存。（ 3） RT - PCR 反应程序（ 两步法） : 预变性 95℃ 30 s,PCR 条件： 95 ℃ 50 s,60 ℃ 30 s,40 个循环，72 ℃ 熔解 10 min.采用 β - actin 做内参对照。总RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒购自 TaKaRa 公司。
1. 2. 3 Western Blot 法检测肝脏 G6Pase、FoxO1 表达（ 1） 提取肝组织蛋白： 采用 BCA 法测定肝组织蛋白浓度。（ 2） 电泳转膜及抗体孵育： 将经过变性的蛋白质进行 SDS - PAGE 电泳，转膜，5% 脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃ 过夜（ 兔抗大鼠多克隆 G6Pase 抗体购自 SANTACRUZ 公司，兔抗大鼠多克隆 FoxO1 抗体购自 Bio-world Technology Inc. ,兔抗人 β - actin 多克隆抗体购自北京奥博森生物技术有限公司； 抗体稀释度分别为β - actin 1∶ 1000、G6Pase 1∶ 500、FoxO1 1∶ 500、AMPK1∶ 500） ,二抗孵育。（ 3 ） 显影及定影： ECL 显影及定影。（ 4） 分析： 使用凝胶图象处理系统自动分析目标条带的分子量和净光密度值，目的蛋白光密度值与内参 β - actin 光密度值的比值代表定量值。
1. 2. 4 分光光度法测定肝糖原含量 采用肝糖原测定试剂盒（ 购自南京建成生物工程研究所） ,按照试剂盒说明书操作。计算公式： 糖原含量（ mg/g 组织） =（ 测定管 OD 值/标准管 OD 值） ×10/1. 11.
