摘 要： 脊髓损伤 (spinal cord injury, SCI) 是一种高发生率、高致残率、高死亡率的中枢神经系统创伤性疾病, 其病理过程主要包括原发性和继发性两个损伤阶段。在骨折、压迫等导致的原发性损伤后, 继发的炎症反应、组织缺氧、神经元坏死凋亡、局部抑制性微环境等一系列病理生理的变化进一步加重了脊髓损伤, 进而导致严重的感觉和运动功能障碍[1,2]。因此, 探究SCI后病理生理改变的发生机制对于脊髓损伤的研究和修复具有极其重要的意义。长链非编码RNAs (long non-coding RNAs, lncRNAs) 被定义为长度大于200个核苷酸的非编码RNA转录本[3]。目前已有研究表明, lncRNAs可以通过调节染色质、转录及转录后修饰来调节下游基因的表达, 这被认为是许多疾病研究的新方向[4]。目前关于lncRNAs在SCI中作用的研究相对较少, 且缺乏较为全面的综述。本文对近年来lncRNAs在SCI中的分子功能相关的研究进行了综述, 并进一步探讨了lncRNAs作为SCI预后相关生物标志物及治疗靶点等方面的潜在作用, 旨在较为全面的了解lncRNAs在SCI中所发挥的作用。
关键词： 长链非编码，RNA，脊髓损伤
1、 lncRNAs的生物发生、分类及功能
1.1、 lncRNAs的生物发生
非编码RNA (Non-coding RNAs, ncRNAs) 在人类基因组中所占比例超过98%[3]。lncRNAs是一类超过200个核苷酸的非编码RNA转录本亚群, 大部分lncRNAs由RNA聚合酶Ⅱ转录, 有5'-甲基化帽子及3'-多聚腺苷酸 (polyA) 尾[3]。lncRNAs最初被认为是转录组的“转录噪音”[4,5]。近年来, lncRNAs的研究迅速发展, 越来越多的研究者认识到lncRNAs是基因表达等许多细胞生命过程的关键调节因子[6]。与信使RNA (messenger RNA, mRNA) 相比, lncRNAs通常受到精细调控, 且具有明显的组织表达特异性和细胞表达特异性[7]。
1.2、 lncRNAs的分类
根据lncRNAs母本基因在基因组中的位置, 可分为五种类型[8,9,10]:a) 正义lncRNAs, 其转录方向与邻近mRNA转录方向相同;b) ) 反义lncRNAs, 其转录方向与邻近mRNA转录方向相反;c) 双向lncRNAs, 该lncR-NAs可同时从与邻近mRNA转录方向相同与相反两个方向发生转录;d) 内含子lncRNAs, 由基因的内含子区转录产生;e) 长链基因间lncRNAs (long intergenic non-coding RNAs, lincRNAs) , 即从两个基因之间的转录产生。
1.3、 lncRNAs的功能
lncRNAs的主要功能[6,7,8,9,10]如下:a) 作为支架分子, 稳定染色质修饰复合物;b) 作为引导分子, 引导包含RNA结合蛋白的蛋白复合体定位到调控位点;c) 作为信号分子, 通过识别转录因子调节靶基因的表达;d作为诱饵分子, 与相应分子结合并阻断其对靶基因的作用;e) 充当miRNA“海绵”, 通过竞争性吸附与mRNA结合的微小RNA (MicroRNA, miRNA) 进而调节mRNA活性;f) 作为增强子RNAs, 甚至可以编码具有调节功能的短肽。但是目前仍有大量lncRNAs的生物学意义尚不清楚, 需要进一步研究阐明。
2、 SCI后lncRNAs的表达变化及其调控
为明确SCI后lncRNAs的表达水平变化及其在脊髓损伤中的作用, 研究者进行了一系列基因芯片和RNA测序研究。Wang等[11]对大鼠脊髓挫伤后1、4、7dlncRNAs的表达进行了大规模筛选, 以错误发现率 (false discovery rate, FDR) ≤0.001且倍数变化≥2的转录本作为差异表达lncR-NAs, 发现在成年大鼠脊髓中7个lncRNAs的表达出现了明显的变化, 其中2个 (LOC100910973, H19) 上调, 1个 (RGD1559747) 下调, 4个 (Rn28s, Rn45s, RT1-CE6, Rmrp) 在SCI后1d上调、4d和7d下调;Ding等[12]在小鼠脊髓挫伤后1d、3d、1周和7周进行基因芯片检测, 结果显示与对照组相比, lncRNAs在SCI后1d几乎没有表达变化, SCI后1周变化达到高峰, 随后出现表达下降。Duran等[13]利用RNA测序研究SCI的亚慢性和慢性阶段 (SCI后1个月、3个月和6个月) lncRNAs表达的变化, 共鉴定到277个差异表达的lncRNAs。这些lncRNAs的研究表明lncRNAs表达变化对SCI后的许多病理生理过程都有影响, 为SCI的分子机制解析提供新的研究方向。
3、 lncRNAs对神经细胞行为的调控作用
3.1、 神经元
脊髓损伤后, 永久性神经元丧失是导致机体感觉、运动功能障碍的一个主要原因, 因此增加SCI后神经元存活对于SCI患者的功能恢复至关重要[1,2]。目前, 已有研究表明调节基因表达可以促进创伤后脊髓神经元的存活, 其中lncRNAs的调节是重要途径[14]。lncRNAs已被发现在中枢神经系统 (Central nervous system, CNS) 发育和神经发生中起到重要作用[15]。同时, 相关研究表明lncRNAs的表达与神经元行为相关[15,16,17,18]。Lv等[16]证实lncRNA-Map2k4可以通过miR-199a/FGF1途径促进神经元增殖并抑制神经元凋亡。Zhang等[17]研究发现抑制内源性lncRNA IGF2AS促进了DRG神经元的生长并可以减轻局部麻醉诱导的神经毒性。Pnky是一种调节神经发生的神经细胞特异性lncRNA[15]。Ramos等[15]的研究表明, 敲低Pnky可促进神经干细胞分化, 这一结果有利于提高SCI患者神经干细胞移植的治疗效果。Han等[18]报道lncRNA H19可能通过“海绵机制”吸附miRNA let-7b, 调节神经元凋亡。以上研究为探索lncRNAs在神经元行为中的作用奠定了良好的基础, 同时预示着调控相关lncRNAs表达可能是修复脊髓损伤的一种潜在方法。
3.2、 星形胶质细胞
星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一种胶质细胞, 它们在向神经元提供能量代谢物和维持细胞外离子平衡方面发挥着重要作用[19]。脊髓损伤后, 星形胶质细胞增殖和反应性胶质增生促进胶质瘢痕的形成, 而胶质瘢痕在SCI局部微环境中作为物理和化学屏障, 抑制脊髓功能的恢复[19]。但是反应性星形胶质细胞也能提供内源性神经保护以及分泌促生长神经营养因子[20]。因此, 如何充分利用其有利方面, 抑制其不利方面, 将是今后的研究重点。最近已有研究开始探索lncRNAs对星形胶质细胞增殖和反应性胶质增生的影响。通过敲低星形胶质细胞中lncSCIR1的表达, 发现lncSCIR1的下调可促进星形胶质细胞的体外增殖和迁移, 并可能在SCI的病理生理过程中发挥着不利作用[11]。另一项研究显示, lncRNA Gm4419可以通过上调炎性细胞因子肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factorα, TNF-α) 的表达来促进创伤诱导的星形胶质细胞凋亡, 而TNF-α的上调可能通过竞争性结合miR-466l来实现[21]。因此, 筛选和鉴定调控星形胶质细胞增殖和活化的关键lncRNAs已成为SCI治疗中的重要问题。
3.3、 少突胶质细胞
少突胶质细胞 (oligodendrocytes, OLs) 的凋亡和轴突脱髓鞘是脊髓损伤继发性损伤的重要组成部分[1,2]。此外, 损伤后微环境中增加的轴突生长抑制因子限制了内源性少突胶质细胞的生成和轴突再髓鞘化过程[22]。因此, 增强轴突再髓鞘化的能力是促进SCI后感觉、运动功能恢复的重要因素之一。近年来, 越来越多的研究发现lncRNAs有望成为脊髓损伤修复的治疗靶点, 因此有必要了解lncRNAs在轴突再髓鞘化中的作用。He等[23]建立了少突胶质细胞不同发育阶段lncRNAs的动态表达谱, 发现lncOL1的过表达可促进大脑发育中早熟的少突胶质细胞分化, lncOL1的失活可导致损伤后CNS轴突髓鞘形成障碍和再髓鞘化缺陷, 此外, lncOL1可通过与Suz12的相互作用促进少突胶质细胞成熟。Dong[24]等的研究表明少突胶质前体细胞 (oligodendrocyte precursor cell, OPC) 的分化过程中受到lncRNAs的调控, 其中lnc-OPC的表达最高, 且在OPC中表现出高度特异性表达。lncRNAs对脊髓神经元轴突髓鞘形成及再髓鞘化的影响仍需进一步研究, 以期为SCI的治疗提供有用的线索。
3.4、 小胶质细胞
脊髓损伤后继发性损伤阶段的炎症反应涉及中枢神经系统内的多种细胞, 包括神经元、大胶质细胞和小胶质细胞, 其中小胶质细胞为主要炎症细胞[1,2]。活化的小胶质细胞可以释放多种促炎分子, 如白介素-1β、TNF-α、活性氧和一氧化氮, 进而介导炎症反应[25]。SCI后, 小胶质细胞的细胞形态和功能发生变化, 小胶质细胞的活化常被用来作为神经系统炎症发生的标志[25]。最近的一项研究表明, 蛛网膜下腔出血 (subarachnoid haemorrhage, SAH) 后早期脑损伤 (early brain injury, EBI) 中, lncRNA fantom3_F730004F19可能通过TLR信号通路 (toll-like receptor signalling pathway) 影响小胶质细胞炎症[26]。Qi等[26]发现lncRNA SNHG14可通过抑制miR-145-5p而增加PLA2G4A的表达, 从而激活小胶质细胞。活化的小胶质细胞可分为两种功能类型:M1型和M2型, M1极化的小胶质细胞通常被认为促进神经元凋亡并抑制OPCs分化为成熟的OLs, 而M2极化的小胶质细胞被认为促进神经元存活、神经突起生长和OPCs分化[27]。Sun等[28]的研究将lncRNA GAS5确定为小胶质细胞极化的表观遗传调控位点, 并认为GAS5可能是治疗脱髓鞘疾病的靶点。Wen等[29]的研究表明, lncRNA Ptprj-as1激活小胶质细胞NF-κB通路, 促进炎性细胞因子分泌, 参与脑出血导致的炎性损伤。
4、 lncRNAs参与脊髓损伤后的炎症反应
脊髓损伤后, 炎症反应包括小胶质细胞的活化和中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞的浸润, 其中中性粒细胞是首先进入损伤部位的主要炎症细胞[30]。研究表明中性粒细胞中存在许多lncRNAs, 并且lncRNAs的表达水平与中性粒细胞的发育、分化和活化相关[31]。已有研究报道lncRNAs在B淋巴细胞和T淋巴细胞的发生发展、活化中具有特异性表达[32,33]。Panzeri等[34]发现lincRNAs可促进人类淋巴细胞分化。Mirsafian等[35]对来自4名患者样本进行单核细胞RNA测序, 并将其数据与其他11个数据集合并分析, 得到了单核细胞中的lncRNAs谱。Huang等[36]发现lncRNA LINC00341可抑制血管细胞黏附分子1 (vascular cell adhesion molecule 1, Vcam1) 的表达和单核细胞粘附, 且具有抗炎作用。Zhang等[37]揭示了lncRNA LINC00305可以通过激活AHRR-NF-κB途径来促进单核细胞炎症。Zhou等[38]的研究表明, 大鼠SCI后lncRNA MALAT1表达明显上调, 上调的lncRNA MALAT1可激活IKKβ/NF-κB通路, 并通过下调miR-199B促进促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的产生;而敲低MALAT1, 可促进SCI大鼠运动功能恢复及抑制炎症因子表达。尽管已有相关文献报道lncRNAs可调节SCI后炎症反应, 但目前大部分lncRNAs调节炎症的相关机制尚不完全清楚。因此, 需要进一步的实验来探索lncRNAs在SCI后调节炎症反应的具体机制。
5、 lncRNAs参与脊髓损伤后的血管形成
脊髓损伤后造成细胞和组织损伤的另一个重要原因是血管损伤引起的缺血缺氧状态[1,2]。因此, 如何促进血管损伤后血管的形成和再通, 为受损脊髓提供氧气、生长因子及其他营养物质的输送, 是脊髓损伤修复的一个关键问题。研究表明, lncRNA HIF1A-AS2可促进缺氧时人脐静脉内皮细胞 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 的血管生成, 其可能作为miR-153-3p海绵促进缺氧诱导因子 (hypoxia inducible factor, HIF-1a) 上调, 进而促进新生血管的形成[39]。lncRNA MEG3被认为是一些癌症的重要的肿瘤抑制剂, MEG3的过度表达显着抑制血管内皮细胞 (vascular endothelial cells, VECs) 中的血管生成[40]。此外, 缺血性卒中后MEG3显着降低, 而过表达MEG3可通过抑制Notch信号降低缺血性卒中后毛细血管密度[41]。因此, MEG3同样可能在SCI后血管生成的控制中发挥重要作用。此外, Fiedler等[42]的研究发现内皮细胞缺氧会诱导两个lincR-NAs:linc00323-003和MIR503HG的表达量增加, 进而促进血管生成。Wang等[43]研究发现, lncRNA snhg 1对脑微血管内皮细胞存活和血管生成具有促进作用, 其依赖于miR-199a, 同时miR-199a参与HIF-1a和血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial cell growth factor, VEGF) 表达的调节。总之, 越来越多的证据表明lncRNA在血管生成中起重要作用, 但是这些lncRNAs在脊髓损伤后血管生成中的作用尚需进一步实验验证。
6、 结论与展望
脊髓损伤是一种严重的创伤性疾病, 其病理生理改变涉及神经系统、免疫系统和血管系统等多个系统, 同时在SCI的发生发展过程中多种分子机制和信号通路参与其中。SCI涉及多种复杂的病理生理过程, 其分子机制尚不完全明确, 目前尚无有效的修复策略修复SCI后的继发性损伤。SCI后lncRNAs的表达变化可能在SCI的病理过程中起着关键作用, lncRNAs的发现和相关研究为SCI的修复提供了新的方向。与可靶向多个mRNAs的miRNAs相比, lncRNAs有更高的组织细胞特异性, 预示着其作为治疗靶点、生物标志物等更具优势。在本综述中, 我们总结了近年来有关lncRNAs在SCI中的研究, 我们认为这一综述将有助于全面了解SCI的分子机制, 为lncRNAs临床应用提供一定的理论依据。
此外, 尚有几个问题可能成为今后研究的重点。首先, 大部分关于lncRNAs对SCI作用的研究都是小动物研究, 为了促进向临床治疗的转化, 还需要对非人灵长类进行相关的研究, 以验证利用lncRNAs修复脊髓损伤在灵长类中的安全性和有效性。其次, 应用lncRNAs治疗需要合适的递送系统, 因此如何选择合适的载体来确保lncRNAs高效、定向的递送到相应靶点是未来的研究方向。同时, SCI中大部分lncRNAs的功能及其发挥作用的分子机制尚不完全清楚, 因此进一步深入了解SCI中lncRNAs的功能及其发挥相应功能的调节机制, 选择关键的lncRNAs, 将为SCI的修复提供新的思路和方向。
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