1. 2. 3 SDS-PAGE 及二维电泳分析 采用 SDS-PAGE 技术，用不连续系统进行垂直板电泳，对蟹总蛋白粗提液组分进行分析。浓缩胶为 5%,分离胶为 10%,蛋白样品与上样缓冲液 1 ∶5混合，煮沸 5min,每孔上样 12 μl,65 V 恒压堆积 20 min,135 V恒压分离，待溴酚蓝指示到达分离胶底部，电泳完毕，考马斯亮蓝染色 1 h,脱色液充分洗脱。
参照文献[15]方法，采用二维电泳进一步对蟹总蛋白粗提液进行分析。水化上样及第一向等电聚焦： 取 100 μl 蟹蛋白粗提液与 400 μl 水化上样缓冲液混合，沿胶条槽自左而右均匀加入 125 μl 样品，由阳性端开始放下胶条，慢慢覆盖在蛋白样品上，并轻轻赶走胶条下的气泡，使水化液浸湿整个胶条，然后在胶条上缓慢覆盖 2 ml 矿物油。盖上盖子，设定等电聚焦程序。胶条的平衡与第二向 SDS-PAGE 电泳： 将胶条取出，分别在平衡缓冲液Ⅰ和平衡缓冲液Ⅱ中平衡 10 min 后，备用。制备 10% 的分离胶，待充分凝固后，用约 50℃的 0. 5% 低熔点琼脂糖封胶液灌入玻璃板缝隙中，轻轻把胶条推到分离胶面上，待琼脂糖凝固后，即可开始电泳。65 V 恒压 10min,135 V 恒压分离，直到溴酚蓝跑到玻璃板底部为止。考马斯亮蓝染色 1 h,脱色液充分洗脱。拍照，分析。
1. 2. 4 Western blot 分析 将蟹蛋白粗提液分别进行一维、二维电泳后，采用半干转方法，15 V 恒压，转印 30 min,将蟹蛋白转印到 PVDF 膜上，然后置于5% 的脱脂奶中室温封闭 2 h,用 TBST 洗 3 次，每次10 min.加入用 TBST 1 ∶ 9 稀释的单例阳性血清，4℃ 反应过夜，用 TBST 洗 3 次，每次 10 min.加入1 ∶1 000 稀释的鼠抗人 IgE-AP 作为标记二抗，室温反应 2 h.TBST 洗 3 次，每次 10 min,加入 AP 底物避光显色10 min,将膜取出用蒸馏水洗净，吹干后观察显色点。
1. 2. 5 质谱分析 将二维电泳上疑似过敏原进行抠点、漂洗、脱色、脱水、干燥、胶内酶切、肽段的抽提和纯化等步骤，得到的样品由北京蛋白质组研究中心协助用蛋白质串联质谱（ MALDI-TOF/TOF） 进行检测，获得被检测样品的肽质量指纹图谱。利用Mascot 软件搜索 NCBI 数据库，寻找匹配的相关蛋白质。
1. 2. 6 斑点免疫印记 以血蓝蛋白作为包被抗原，阳性血清 sIgE 作为识别抗体，进行斑点免疫印记实验。方法如下： 将血蓝蛋白用 0. 01 mol/L PBS 溶解，终浓度为 5 mg/ml.将 2 μl 血蓝蛋白点于 NC膜上，待其干燥，羊抗鼠 IgG 作为阳性对照，PBS 作为阴性对照。用 TBST 洗 10 min,然后将 NC 膜放入1min.将封闭好的 NC 膜分别与 24 份 1 ∶9 稀释的阳性及阴性血清室温反应 2 h,TBST 洗三次，每次 10min.加入 1 ∶1 000 稀释的鼠抗人 IgE-HRP 作为二抗，室温反应 2 h.TBST 洗3 次，每次10 min,曝光，观察结果。
2 结果
2. 1 蟹蛋白粗提液蛋白组分分析 蟹蛋白粗提液的 SDS-PAGE 结果如图 1 所示，至少有 18 条明显的蛋白条带。其中，20、34、40 kD 处分别为已知的肌质钙结合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶。在 70 ~90 kD 之间有四条明显的条带，但该分子量范围内的蛋白尚未见相关报道。二维电泳分析结果与SDS-PAGE 结果一致，大部分蛋白组分的等电点在4 ~ 9 之间，其中，25 ~ 45 kD 之间的蛋白着色最深，含量最丰富，应多为已报道的原肌球蛋白及精氨酸激酶。在等电点 5. 2、70 ~80 kD 处可分辨两个明显的点。结果与 SDS-PAGE 结果相符。
2. 2 蟹中过敏组分分析 蟹总蛋白提取液经一维印记分析，结果如图 2A 所示，中华绒螯蟹过敏原中，除 34 kD 原肌球蛋白、40 kD 精氨酸激酶外，55kD 以上的高分子量蛋白占有很大比例，且 70 ~ 80kD 处反应条带较深。利用二维印记，使用混合阳性血清作为探针进一步分析，结果如图 2B 所示，25 ~45 kD 处出现多个阳性反应点，与已报道的研究结果相符。同时，70 ~80 kD 处出现了阳性反应点，证明该处蛋白是中华绒螯蟹中的过敏原。
2. 3 质谱分析结果 对二维电泳 70 ~ 90 kD 处两个蛋白点进行质谱分析，肽指纹图谱及质谱结果如图3、表1 所示，其中，图3A 为疑似蛋白1,普库索取号为 gi|334145788 ,预测分子量为 78 390,等电点约为 5. 21,Mascot 得分为 107,有 16 个肽段可与中华 绒螯蟹血蓝蛋白匹配； 图3B为疑似蛋白2,Mascot 得分为 209,有 29 个肽段可以与中华绒螯蟹血蓝蛋白匹配。
3. 4 斑点免疫印记实验结果 使用血蓝蛋白作为包被抗原，进行斑点免疫印记实验，结果如图 4 所示，在23 例阳性血清中，14 例与血蓝蛋白反应，9 例无反应。血蓝蛋白的反应率为 61%.
3 讨论
中华绒螯蟹作为我国主要的甲壳类食物之一，是我国常报道的食物过敏反应原因。在蟹类过敏原中，36 kD 处原肌球蛋白研究最为广泛，是多种蟹类中的主要过敏原，如马鬃蟹、帝王蟹、雪蟹和青蟹[16]等。除了原肌球蛋白，40 kD 处精氨酸激酶、20 kD处肌质钙结合蛋白，23 kD 处肌钙蛋白，42 kD 处 α-actine 和 113 kD 处 Ca2+ATP 酶四个潜在的过敏原[17],也陆续被检测到。
然而，由于蟹中含有极其丰富的蛋白质，且蛋白种类繁多，其中致敏原组分尚未完全揭示。通过与蟹过敏病人血清的 Western blot 实验发现，中华绒螯蟹中可与血清 sIgE 结合的过敏原组分多种多样，且尚未完全被阐明。本文的主要目的就是探寻中华绒螯蟹中未报道的过敏原。
通过 SDS-PAGE 分析，蟹总蛋白粗提液包含20、36、40、113 kD 等主要过敏原，蛋白组份完整，且蛋白条带清晰，说明我们的蟹总蛋白粗提液可用于后续研究。除已报道的几种过敏原外，在 70 ~ 90kD 间，有四条明显的蛋白条带，且该区域蛋白尚未见报道。随着蛋白质研究技术的逐步完善，双向电泳和质谱的联用已成为蛋白分析的核心技术，因此，我们采用二维电泳技术进行进一步分析，发现该分子量范围内的两个蛋白在同一等电点，推测可能为同一种蛋白。用混合阳性血清作为识别抗体，发现该处蛋白可与阳性血清反应，证明该蛋白为中华绒螯蟹的一种过敏原。胰酶消化后，对该处蛋白进行质谱分析，该处蛋白与中华绒螯蟹中血蓝蛋白相匹配，且 Mascot 得分均较高，证明该处蛋白均为血蓝蛋白，即血蓝蛋白是中华绒螯蟹的一种新型过敏原。
血蓝蛋白（ Hemocyanin） 是许多软体动物、节肢动物中一种的运输糖蛋白，具有酚氧化物酶活性和抗菌、抗癌功能，被认为是一种重要的免疫分子[18].中华绒螯蟹中血蓝蛋白[19]cDNA 长 2 573 bp,其中2 064 bp 为开放阅读框，编码 688 个氨基酸，计算得到的分子量为 77 997. 31 Da,理论上的 PI 值为4. 93,血蓝蛋白与血红蛋白分子类似，也是一种多亚基组成的分子。
为了评估血蓝蛋白是否为中华绒螯蟹中的主要过敏原，我们需要确定血蓝蛋白与阳性血清的反应率。我们用血蓝蛋白作为包被抗原，进行斑点印记实验，发现血蓝蛋白的反应率为 61%,证实血蓝蛋白为中华绒螯蟹的一种主要的过敏原。本文通过SDS-PAGE、二维电泳及 Western blot 分析蟹中过敏原组分并进行比对，再通过质谱分析鉴定中华绒螯蟹中 70 ~90 kD 处新型的过敏原---血蓝蛋白，并通过斑点免疫印记实验证明血蓝蛋白是中华绒螯蟹中的一种主要的过敏原。同时，探索了鉴定过敏原的方法，为中华绒螯蟹其他新型过敏原的发现、研究奠定了基础。更重要的是，通过对蟹类过敏原认识的深入，为过敏性疾病的检测提供更标准化、高质量的已知抗原，为研制新一代的检测试剂提供实验依据。
参考文献：
[1] Elizabeth HT,Mohana R,Lynette P Shek ,et al. Prevention of foodallergy in the real life[J]. Asian Pac J Allerg Immunol ,2014,32（ 1） : 16-24.
[2] Andrew WK,Sarah DS,Jennifer M,et al. Diagnosis and manage-ment of food allergies: new and emerging options: a systematic re-view[J]. Asthma and Allergy,2014,（ 7） : 141-164.
[3] Mehta H,Groetch M,WANG J,et al. Growth and nutritioal con-cerns in children with food allergy[J]. Curr Opin Allergy Chin Im-munol,2013,13（ 3） : 275-279.
[4] Abramoritch JB,Kamath S,Varese N,et al. IgE reactivity of blueswimmer crab （ Portunus pelagicus） tropomyosin,Por p 1,and otherallergens; cross-reactivity with black tiger prawn and effects ofheating[J]. PLoS One,2013,8（ 6） : e67487.
[5] 孙一帆，黄建芳，王彩霞，等 . 中国人的虾、蟹致敏过敏原组分分析[J]. 中国免疫学杂志，2014,30（ 10） : 1325-1329.
