摘要：目的 比较3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养病毒制备的森林脑炎灭活疫苗的产量及质量。方法 分别采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器培养Vero细胞， 3 L转瓶培养细胞96 h后感染SZV株森林脑炎病毒 （MOI=0.01、0.04、0.1及0.4） , 培养至8096 h收获第1次， 每隔48 h收获1次 （500 m L/次） ;14 L生物反应器培养Vero细胞7 d后感染SZV株森林脑炎病毒 （MOI=0.01、0.04、0.1及0.4） , 感染后96 h开始流加病毒维持液， 并收获病毒液， 每24 h收获1015 L.两种培养方式收获的森林脑炎病毒液经超滤浓缩、β-丙内酯灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液， 并进行相关检定。结果 4种MOI感染Vero细胞， 采用3 L转瓶方式培养可连续收获67次， 病毒液产量为33.5 L, 收获液平均滴度为7.4 lgLD50/m L;采用14 L篮式生物反应器培养可连续收获14 d, 病毒产量140160 L, 收获液平均滴度高达8.4 lgLD50/m L.两种方法制备森林脑炎灭活疫苗原液各项质量指标均合格， 且14 L篮式生物反应器制备原液的效力及蛋白含量优于3 L转瓶。结论 应用生物反应器培养工艺制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的产量及质量高于转瓶培养工艺， 本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。
关键词：14L篮式生物反应器； 3L转瓶； 森林脑炎灭活疫苗；
森林脑炎是由森林脑炎病毒引起的自然疫源性疾病[1], 是一种急性病毒性传染病， 也是一种危害人类健康的重要传染病[2-3].接种疫苗是控制该病流行最经济有效的措施[4].Vero细胞是世界卫生组织 （WHO） 推荐用于疫苗生产的传代细胞， 已成功用于多种人用疫苗的研究及生产[5], 如人用狂犬病疫苗、出血热疫苗、乙脑疫苗等， 可进行连续培养， 多次收获[6].同时， Vero细胞可通过高密度罐培养的方式增加产量[7].
本研究通过采用3 L转瓶和14 L篮式生物反应器两种培养方式培养Vero细胞， 并用于制备森林脑炎病毒收获液， 经纯化后获得森林脑炎灭活疫苗， 参照《中国药典》三部 （2010版） [8]要求及本公司自定标准进行检测， 并将结果进行比较， 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞及病毒
141代Vero细胞及SZV株森林脑炎病毒均由本公司疫苗三室保存。
1.2 主要试剂及仪器
199培养基 （干粉） 购自美国Gibco公司；新生牛血清购自山西润生大业生物材料有限公司；β-丙内酯购自美国Sigma公司；14 L New Brunswick Scientific生物反应器 （Celli Gen 310型） 及片状载体购自台湾CESCO Bioengineering公司；Sepharose 4FF凝胶过滤介质购自美国GE Healthcare公司；地高辛DNA标记及检测试剂盒购自瑞士Roche公司；Vero细胞残留蛋白检测试剂盒购自北京天坛生物制品股份有限公司；牛血清白蛋白ELISA检测试剂盒购自无锡博生医用生物技术开发有限公司。
1.3 溶液配制
199培养液：取199培养基 （干粉） 954.9 g, 溶解于10 L灭菌注射水中， 最终定容至100 L, 搅拌至充分溶解， 用0.22μm无菌滤膜过滤除菌， 分装， 4℃保存；细胞生长液：含5%~10%新生牛血清的199培养液， 用Na HCO3溶液 （7.5%） 调节p H至6.8~7.2;病毒维持液：含1%~2%新生牛血清的199培养液， 用Na HCO3溶液 （7.5%） 调节p H至7.2~7.6.
1.4 3 L转瓶培养
将141代Vero细胞传至148代， 按每瓶30 m L细胞悬液接种至3 L转瓶， 加入细胞生长液至500 m L, 于 （37±1） ℃培养72~96 h后， 分别按MOI=0.01、0.04、0.1、0.4接种SZV株森林脑炎病毒， 补加细胞维持液至500 m L, 继续培养80~96 h, 收获病毒液500 m L, 更换新鲜维持液并继续培养， 每48 h收获1次， 每次收获均取样检测， 于-70℃冻存。
1.5 14 L篮式生物反应器培养
14 L篮式生物反应器共加入片状载体300~500 g, 121℃高压灭菌1 h, 无菌验证合格后， 按 （4~6） ×109个/m L的密度将148代Vero细胞10 L接种于篮式生物反应器内， 细胞培养温度设定为37℃， p H设定为7.0, DO设定为70%, 调整转速为80 r/mim.接种细胞24 h后开始流加细胞生长液， 培养7 d （至细胞平台期） , 分别按MOI=0.01、0.04、0.1、0.4接种SZV株森林脑炎病毒， 用细胞维持液进行培养， 将生物反应器培养温度设定为33℃， p H设定为7.4, DO设定为70%, 转速为100 r/min.感染80~90 h后开始流加病毒维持液， 并收获病毒液， 每24 h收获10~15 L, 收获速度与补加维持液速度相同， 并取样检测， 于-70℃冻存。
1.6 疫苗原液的制备及检定
分别将检定合格的转瓶及篮式生物反应器制备的森林脑炎病毒收获液进行合并， 澄清过滤后收集滤液。以截留相对分子质量300 000的超滤膜包将病毒收获液进行40~60倍浓缩。将浓缩病毒收获液经1∶4 000 （V/V） 的β-丙内酯于4℃灭活48 h后， 置37℃水解2 h.再通过Sepharose 4FF柱层析纯化， 收集第1峰， 除菌后即为森林脑炎疫苗原液。参照《中国药典》三部 （2010版） [8]要求及本公司自定标准对原液进行Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白质残余量、牛血清白蛋白残留量、蛋白质含量、无菌检查及抗原含量等检测。
2 结果
2.1 3 L转瓶的细胞生长状态及接种病毒后细胞病变情况
Vero细胞接种于3 L转瓶培养72~96 h后可长成致密单层， 接种SZV株森林脑炎病毒后， 可连续收获6次， 均未见明显细胞病变， 以MOI=0.1为例， 见图1.
2.2 森林脑炎病毒的滴度及收获次数
2.2.1 3 L转瓶培养
SZV株森林脑炎病毒按MOI=0.01感染Vero细胞时， 可连续收获7次， 病毒滴度为6.75~7.75 lg LD50/m L;按MOI=0.04感染Vero细胞时， 可连续收获6次， 病毒滴度为6.75~7.75 lg LD50/m L;按MOI=0.1感染Vero细胞时， 可连续收获6次， 病毒滴度为7.0~7.9 lg LD50/m L;按MOI=0.4感染Vero细胞时， 可连续收获7次， 病毒滴度为7.1~7.75 lg LD50/m L.见图2.4种MOI感染Vero细胞， 采用3 L转瓶方式培养可连续收获6~7次， 病毒液产量为3~3.5 L, 收获液平均滴度为7.4 lg LD50/m L.
A:细胞接种24 h;B:细胞接种48 h;C:细胞接种72 h;D:接种病毒后4 d;E:接种病毒后6 d;F:接种病毒后8 d;G:接种病毒后10 d;H:接种病毒后12 d;I:接种病毒后14 d.
2.2.2 14 L生物反应器培养
SZV株森林脑炎病毒按4种不同MOI感染Vero细胞， 均可连续收获14 d （共14次） , 病毒产量140~160 L, 收获液平均滴度高达8.4 lg LD50/m L.MOI=0.01、0.04、0.1、0.4时最高病毒滴度分别为9.00、8.90、8.75、9.00 lg LD50/m L, 均可达到较高病毒滴度 （8.0 lg LD50/m L） , 但达到较高滴度的时间不同， 分别为11、9、7、8 d.见图3.
2.2.3 两种培养方式培养森林脑炎病毒滴度和收获次数的比较
以MOI=0.1为例， 14 L篮式生物反应器培养收获病毒液次数多于3 L转瓶培养， 且收获液病毒滴度亦高于3 L转瓶培养。见图4.
2.3 疫苗原液主要检定结果
两种方式培养森林脑炎病毒制备的疫苗原液经检测， 各项指标均合格， 且14 L篮式生物反应器制备疫苗的效力及蛋白质含量优于3 L转瓶， 同时宿主蛋白残留量及牛血清蛋白残留量均低于3 L转瓶。见表1.
3 讨论
Vero细胞培养可采用转瓶、篮式片状载体、微载体等方式进行培养[9], 生物反应器培养工艺获得的细胞密度较大， 且片状载体可吸附脱落的细胞和宿主蛋白， 易得到较高质量的收获液[10].本实验采用3 L转瓶及14 L篮式生物反应器分别培养森林脑炎病毒， 并进行对比分析， 结果显示， 14 L篮式生物反应器工作体积为10 L, 为3 L转瓶工作体积的20倍；14 L篮式生物反应器平均病毒滴度为8.4 lg LD50/m L, 3 L转瓶平均病毒滴度为7.4 lg LD50/m L;14 L篮式生物反应器收获次数为14次， 病毒产量140~160 L, 3 L转瓶仅能收获6~7次， 病毒液产量为3~3.5 L.表明14 L篮式生物反应器制备疫苗原液的病毒滴度、病毒产量、疫苗质量均大幅提高[11].同时， 生物反应器培养工艺的产品质量批间差异小， 能源消耗少， 劳动力强度小， 生产效益明显高于转瓶生产工艺[12].
利用14 L生物反应器进行Vero细胞培养制备森林脑炎病毒， 可获得更高病毒滴度的病毒收获液， 生产过程易于控制， 能大量降低劳动成本， 提高单产。且部分指标优于3 L转瓶培养。本实验为生物反应器制备Vero细胞森林脑炎病毒灭活疫苗的大规模生产及工艺改进奠定了基础。
参考文献
[1]HOLBROOK M R.Kyasanur forest disease[J].Antiviral Res, 2012, 96 （3） :353-362.
[2]THOMAS S J, ENDY T P, ROTHMAN A L, et al.Flaviviruses （dengue, yellow fever, Japanese encephalitis, West Nile encephalitis, St.Louis encephalitis, tick-borne encephalitis, Kyasanur Forest disease, Alkhurma hemorrhagic fever, Zika） [M].Elsevier Inc., 2015-06-15.
[3]BOGOVIC P, STRLE F.Tick-borne encephalitis:A review of epidemiology, clinical characteristics, and management[J].World J Clin Cases, 2015, 3 （5） :430-441.
[4]SONG Z M, HAN L, GUO X, et al.Preparation of purified tick-borne encephalitis vaccine[J].Chin J Biologicals, 2002, 15 （1） :32-34. （in Chinese） 宋宗明， 韩亮， 郭新， 等。森林脑炎纯化疫苗的研究[J].中国生物制品学杂志， 2002, 15 （1） :32-34.
[5]DUAN P P.Optimization of serum-free medium for vero cells and application of the influenza virus[D].Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College, 2015. （in Chinese） 段盼盼。Vero细胞无血清培养基的研制及其在流感病毒培养中的应用[D].北京：中国医学科学院北京协和医学院， 2015.
[6]SIENNICKA J, TRZCINSKA A, GUT W.Immunity against tick borne encephalitis virus （TBE） in population of forest workers in Bialowieza[J].Przegl Epidemiol, 2010, 64 （2） :303-305.
[7]ZHAO B.Bioreactor application to establish production technology of hemmorhagic fever with renal syndrome bivalent vaccine （vero cells） , inactivated[D].Changchun:Jilin University, 2012. （in Chinese） 赵斌。应用生物反应器建立双价肾综合征出血热灭活疫苗 （Vero细胞） 生产工艺的研究[D].吉林长春：吉林大学， 2012.
[8]国家药典委员会。中华人民共和国药典 （三部） [S].北京：中国医药科技出版社， 2010:95-97.
[9]BIERNAT B, KARBOWIAK G, STANCZAK J, et al.The first detection of the tick-borne encephalitis virus （TBEV） RNA in Dermacentor reticulatus ticks collected from the lowland European bison （Bison bonasus bonasus L.） [J].Acta Parasitologica, 2016, 61 （1） :130-135. （in Chinese）
[10]QIAO H L.Technological research of bioreactor of production TBEV antigen in VERO cells[D].Changchun:Jilin University, 2016. （in Chinese） 乔宏雷。生物反应器 （VERO细胞） 培养森脑病毒工艺的摸索[D].吉林长春：吉林大学， 2016.
[11]LI W, SUN Z P, SUN Y, et al.Comparisons of the cell cultivation between using microcarrier in a 15 L bioreactor and roller bottle for the preparation of JEV vaccine[J].Prog in Microbiol Immunol, 2008, 36 （4） :11-15. （in Chinese） 李薇， 孙振鹏， 孙燕， 等。转瓶培养与生物反应器微载体培养乙脑病毒的比较[J].微生物学免疫学进展， 2008, 36 （4） :11-15.
[12]KUNZE U.Report of the 19th Annual Meeting of the International Scientific Working Group on Tick-Borne Encephalitis （ISW-TBE） TBE in a changing world[J].Ticks and Tick Borne Dis, 2018, 9 （2） :146-150.
