摘要：单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性， 已广泛应用于自身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的治疗。单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位， 确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中的关键步骤。本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方法， 包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱 （hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS） 、生物信息学表位预测方法的原理、特点及研究进展作一综述。
关键词：单克隆抗体； 抗原表位； 酶联免疫吸附试验； 噬菌体随机肽库； X-射线晶体学； 丙氨酸扫描； 氢氘交换质谱； 生物信息学；
单克隆抗体技术的出现不仅促进了免疫学的发展， 也促进了许多其他学科的发展， 该技术广泛用于医学领域， 已成为重要的临床诊断手段和有效的药物治疗方法[1], 特别是治疗性单克隆抗体已成为近几年来生物制药业发展最快的领域之一[2], 同时， 也为一些新技术提供了基础平台， 如抗体偶联药物[3]、双特异性抗体[4]及新兴的CAR-T细胞治疗[5-6].由于单克隆抗体具有高度均一性及对靶分子的高亲和性、特异性， 极大改变了医学实践， 提高了病患的生存质量， 挽救了更多患者的生命。单克隆抗体作为一种治疗恶性肿瘤和炎症性疾病的被动免疫制剂进入临床使用， 再进一步发展至其他领域， 包括神经系统疾病 （如阿尔兹海默病等） 及自身免疫疾病 （如红斑狼疮等） [7].
抗体功能取决于其与靶抗原结合的表位， 表位是抗原的一部分， 与抗体的可变区结合， 与不同表位结合发挥特定的功能， 这些功能可能表现为抑制活性或激活某个信号等。单克隆抗体的表位分析能促进抗体治疗的发展， 指导疫苗的设计， 评估免疫者体内保护性抗体的反应， 或是定位抗菌剂作用于病原微生物的靶点[8].单克隆抗体与相应抗原的反应性决定于其所识别的抗原表位， 确定相应表位在抗原结构上的位置是单克隆抗体筛选中关键步骤[9].同时， 可进一步分析这类表位的差异， 正确评价单克隆抗体的特异性和交叉反应性， 可用于评价某抗原表位是某种菌株不同血清型的共同表位， 还是特异表位。
随着抗体技术的发展， 抗原表位分析显得尤为重要， 本文主要对几种单克隆抗体表位的分析方法， 包括ELISA法、生物酶解法及化学切割法、噬菌体随机肽库、X-射线晶体学、丙氨酸扫描、氢氘交换质谱 （hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS） 、生物信息学表位预测方法的原理、特点及研究进展作一综述。
1 ELISA法
ELISA法操作简便， 是单克隆抗体表位分析最常用的方法。本文主要介绍ELISA法中最常用的两种：ELISA相加试验和竞争抑制试验 （c ELISA） .这两种方法的基本原理均为双抗体竞争， 可用于进行大批单克隆抗体的系统筛选。相加试验采用了高效价的酶标二抗作为指示系统， 重复性和敏感性均较良好；c ELISA法也较精确， 但需对待检的一株或数株单克隆抗体进行纯化和标记。
1.1 ELISA相加试验
该方法首先将抗原分别与两种单克隆抗体作饱和曲线， 确定能使抗原饱和的适宜抗体浓度， 分别将第1种、第2种饱和浓度及两种饱和浓度的单克隆混合物与该抗原结合， 测定相应A450, 分别为A1、A2及A1+2, 通过A值得到相加指数 （AI） , 公式为AI （%） =[2×A1+2/ （A1+A2） -1]×100%.如单克隆抗体浓度可将抗原饱和， 当两种单抗针对相同表位时， AI将趋近于0, 两种抗体的表位不同的， AI将接近100%, 结果一般以AI>或<50%进行判定。FRIGUET等[10]首次使用该方法来鉴别两种单抗识别的表位是否相同， 实验检测了7种不同的抗大肠埃希菌色氨酸合成酶β2亚基单克隆抗体， 首先用纯化抗原包板， 再将两种抗体分别或同时加入， 结果表明， 其中5株单抗识别相同表位， 其他2株识别其他表位。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂C （Cys C） 是一个优良的肾功能标志物， 尤其在评价早期急性肾损伤方面。ZHA等[11]首先筛选4种杂交瘤细胞系来获得Cys C单克隆抗体， 通过ELISA相加试验发现， 有4组单抗的AI>50%, 识别不同的表位， 2组单抗的AI值<50%, 识别相同的表位。CAO等[12]通过ELISA相加试验证实， 抗羊白介素-18单克隆抗体2E8和4C4针对不同表位。SHI等[13]对抗丙型肝炎病毒 （hepatitis C virus, HCV） 单克隆抗体进行表位分析， 再将4种抗体分为6组进行相加试验， 发现3组AI值>50%, 识别不同表位。
1.2 c ELISA法
实验时， 抗原包板后同时加入未标记的待检单克隆抗体和酶标的对照单克隆抗体， 当两种单克隆抗体的表位特异性相同时， 酶标对照单克隆抗体与待检单克隆抗体发生竞争， 从而出现抑制现象。通过检测A450计算抑制率， 计算方式多样， 仅列出3种：抑制率 （%） =[ （A基点对照-A抑制） /A基点对照]×100%、抑制率=log2 （A抑制/A基点对照） 、抑制率 （%） =[ （1-A抑制） /A基点对照]×100%, 其中A基点对照为酶标对照组， 不加任何竞争抗体；A抑制为两种单抗存在时的测量值。当酶标对照单抗无其他竞争抗体时， A值为最大， 计算结果越接近100%, 说明两种抗体识别的表位越接近；越接近0, 说明两种抗体识别的表位相关性越小。
KOBAYASHI等[14]用重组戊型肝炎病毒蛋白 （HEV ORF2-G4） 包板， 再将生物素化的单克隆抗体及未标记的单克隆抗体在PBS-BSA中预先混合后加入板中， 识别乙肝病毒的单克隆抗体作为阴性对照， 反应结束后测定A450.通过公式抑制率 （%） =[ （1-A抑制） /A基点对照]×100%来计算抑制率， 经9株单克隆抗体的竞争ELISA试验表明， H6206、H6219、H6222、H6235、H6242和H6253这6株抗体中， 标记1种抗体， 分别加入其他5种抗体时， 抑制率在71.2%~100%之间， 生物素化抗体与抗原的结合几乎完全被抑制， 表明6株抗体识别相同或重叠表位；另外3种抗体H6210、H6225和H6249中， H6210可部分抑制生物素化的H6225和H6249, 抑制率分别为38.0%和27.4%, H6225与生物素化的H6210和H6249的抑制率分别为54.2%和52.5%, H6249与生物素化的H6210和H6225的抑制率分别为55.4%和48.3%, 表明H6210、H6225和H6249抗体可能识别不同， 但空间位置相关的表位。YU等[15]通过一组c ELISA试验评估单克隆抗体 （包括20种人单克隆抗体和11种鼠单克隆抗体） 与新布尼亚病毒 （severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus, SFTSV） N蛋白表位的结合特异性， 用抗原包板后， 加入人或鼠单克隆抗体和HRP标记的单克隆抗体， 通过检测A450计算抑制率， 公式为：抑制率 （%） =[ （A基点对照-A抑制） /A基点对照]×100%, 选择Western blot试验中蛋白带为阳性的抗体为HRP标记抗体， 共20种人单抗和11种鼠单克隆抗体作为竞争抗体， 根据抑制率推测， N蛋白上至少有4个不同的结合表位。
ZHAO等[16]通过c ELISA对23株抗HEV单克隆抗体进行表位分析以提高对表位空间构型的理解， 这组单克隆抗体均识别HEV的E2s结构域。该实验是用HRP标记单抗， 通过公式抑制率=log2 （A抑制/A基点对照） 计算抑制率。实验通过23×23c ELISA得到了大量的数据， 并用SPSS 18.0软件对数据处理进行表位分类。与传统的c ELISA数据分析不同， 单克隆抗体之间的抑制率并不是以百分比表示， 而是转换为-4~0间的值 （与抑制率0~93.7%一致） , 该方法具有更高直观性和精确性， 并能高效分析数据。该方法定义了两种参数：blocking参数用来描述一种单抗对其他23种单抗 （包括此抗体本身） 的抑制能力；blocked参数代表一种单抗被其他单抗抑制的程度。每种单抗通过实验可得到46个参数， 通过这两种参数来描述每种单克隆抗体表位与其余22种单克隆抗体表位的空间关系特征。单克隆抗体之间的相似程度使用树状图描述， 单克隆抗体间距以1~25之间的数字表示， 值越小表示单克隆抗体表位间的距离越近， 反之则距离越远；距离值<5有相似的图像描述， 则归为同一类， 由此判定23种单抗可分为6类， 表明HEV衣壳蛋白E2s结构域至少由6种不用构象依赖的表位组成。
2 生物酶解法及化学切割法
生物酶解法及化学切割法为传统的表位分析方法， 是通过化学或生物处理抗原分子以获得长短不同的多肽片段， 再利用单克隆抗体筛选可与其发生阳性反应的片段， 分析阳性片段的氨基酸序列后合成该序列， 进而确定起关键作用的单个氨基酸。TRUDEL等[17]通过分析呼吸道合胞病毒 （respiratory syncytial virus, RSV） 的化学切割和酶解产物， 得到了抗RSV单克隆抗体识别的表位， 主要位于中和表位上一个相对分子质量7 000的裂解片段。
该方法合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位， 因此不适用于构象表位 （完整蛋白质的抗原表位中， 90%是构象表位， 仅10%为线性抗原表位） , 构象表位会被切割、変性条件及表位自身的裂解所影响， 使原有的构象发生改变[18-19].由于费时费力， 且对抗原表位的类型要求严苛， 这种表位分析方法的应用并不广泛。
基于该原理还有另一种方法， 依据推测的抗原表位区域， 通过基因工程手段将该区域的多肽截短表达， 相邻点的肽序列相互重叠， 以确保连续呈现， 再采用ELISA和Western blot法检测单克隆抗体与不同截短表达蛋白的的反应来推知不同单抗识别的表位区域， 这种方法的工作量较大， 主要筛查的也是线性表位。HAMAOKA等[20]将肝素结合表皮生长因子多肽截短表达为6段， 通过ELISA法检测8种单克隆抗体与截短肽段的结合情况， 共得到3种不同的结果， 说明8种单克隆抗体至少识别3种不同的表位。WEBER[21]等将组织蛋白原B基因序列截短合成后通过Western blot检测， 结果表明， 待测抗体识别出5个不同的表位。
3 噬菌体随机肽库
1990年， SCOTT等[22]首次将噬菌体多肽库应用于筛选抗原表位， 自此， 国内外学者进行了大量的相关研究。
组合噬菌体文库是高通量筛选蛋白质相互作用的有力工具， 在所有可用的分子显示技术中， 噬菌体展示技术是最常用的方法[23].噬菌体展示技术是一种基因表达产物与亲和选择相结合的技术， 这项技术的主要原理是将蛋白质或多肽的DNA序列插入至噬菌体颗粒外壳蛋白的一个结构基因的适当位置， 外源基因随外壳蛋白的表达而表达， 被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物活性， 通过反复的亲和选择和扩增， 可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些生物活性并分离出带有目的基因的噬菌体。
从噬菌体随机肽库中筛选抗原表位的基本原理是生物淘选， 利用单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位， 获取抗体亲和性模拟肽， 对模拟肽集合进行比对处理， 获得探针基序， 然后利用探针基序在抗原蛋白表面搜索最佳匹配的氨基酸序列， 获得的序列即作为预测结果。该方法是基于目的单克隆抗体对噬菌体展示短肽的亲和选择[24-25].具体操作程序为：在聚乙烯板上包被单克隆抗体， 再加入噬菌体肽库， 使其充分反应， 洗去未结合的噬菌体， 使已结合的噬菌体洗脱下来， 将其感染的大肠埃希菌扩增后回收， 再次与已包被单克隆抗体发生反应， 进行下一轮筛选[26].一般通过3、4轮筛选可获得与单克隆抗体结合较紧密的噬菌体颗粒。通过DNA序列分析， 能定位该噬菌体克隆所携带的外源肽序列， 从而可知该单抗所识别的抗原表位序列。
HE等[27]利用噬菌体随机肽库方法研究抗牛痘病毒抗原A33单克隆抗体 （MAb-1G10） 识别的表位， 通过实验得到了表位的构成及结合的关键残基。包膜糖蛋白E2和Erns是猪瘟疫病毒与细胞表面受体作用的媒介， ZHANG等[28]使用噬菌体展示技术研究单克隆抗体识别E2和Erns的表位， 结果显示， 两株E2特异性抗体有共同的结合模拟肽， 该肽序列与E2蛋白的其中一段序列相似；两株Erns特异性单克隆抗体也有共同的结合模体， 其中一种单克隆抗体存在另一种不同的结合模体。高源等[29]以白介素-15 （interleukin-15, IL-15） 单克隆抗体为靶分子， 对噬菌体7肽库进行了3轮体外生物淘选， 再通过ELISA法鉴定第3轮洗脱下来的噬菌体， 挑选了15种与IL-15单克隆抗体结合力较强的噬菌体， 再将这15个克隆进行DNA序列测定， 得到4组7肽序列， 并通过噬菌体ELISA和c ELISA法证明了4组多肽结合的特异性。
噬菌体肽库技术解决了传统筛选方法只能获得抗原线性表位的问题， 该方法不仅能确定抗原的线性表位， 且可分析构象表位。对于不连续的抗原表位， 只能通过噬菌体短肽库获得模拟表位， 这些模拟表位虽能特异性结合抗体， 但氨基酸序列与天然蛋白质的氨基酸序列不完全相同， 需进一步结合抗原结构分析的资料来明确。
4 X-射线晶体学
X-射线分辨单克隆抗体-抗原复合物是分析单克隆抗体识别表位的最可靠方法， 该方法基于对单克隆抗体-抗原共晶体衍射的X-射线束的强度和角度测量， 再用生物信息学的方法确定原子坐标， 将复合体的三维结构完整可视化[30-31].
N62是土拉弗朗西斯菌的单克隆抗体， LU等[32]通过单克隆抗体N62的Fab段X-射线晶体结构显示， 抗原结合区域是由芳香族氨基酸组成， 芳香族氨基酸形成了一个小的凹处， 容纳不超过4/3个糖残基， 表明N62主要与土拉弗朗西斯菌O抗原非还原端末端的Qui4NFm残基结合。Mnt C是金黄色葡萄球菌转运蛋白， 目前， 正在对作为金黄色葡萄球菌疫苗的组分进行研究， GRIBENKO等[33]应用X射线晶体学分析Mnt C与其单克隆抗体305-78-7的复合体， 结果显示， 305-78-7与Mnt C的C-末端小叶结合， α-helixα8和β-sheetβ8组成了抗原抗体的主要接触面， 另外， Mnt C的E247可能与抗体重链上的K58形成了盐桥。
应用该方法首先需获得纯度较高的抗原、抗体， 并使其相互作用形成共晶， 但由于成本及技术要求较高， 难以建立结晶条件， 某些细菌或病毒蛋白产量过低等原因， 此方法并未广泛使用。
5 丙氨酸扫描
丙氨酸扫描法的原理是在抗原氨基酸主要序列模板上引入丙氨酸突变后， 对可能影响单克隆抗体与抗原结合的氨基酸改变进行评估以确定表位的位置。用丙氨酸进行突变是由于其相对分子质量小且带电荷为中性， 某些情况下， 如表位已包含丙氨酸或是有糖基化位点存在时， 可用其他氨基酸进行突变[34].在不同氨基酸位置形成丙氨酸突变后， 所有携带丙氨酸突变的蛋白质可用结合实验来检测， 与未进行突变之前的结合比较， 若突变体显示与单克隆抗体结合力变低， 那么其携带的突变可能参与单克隆抗体的结合， 由此可推断该突变位置可能是单克隆抗体表位的一部分[35].但突变分析方法并不适合常以多聚体形式出现的抗原， 表位氨基酸突变可能引起表位结构的改变， 从而导致抗原失去多聚体形式或完全不表达[36].
KECK等[37]通过对HCV的H77C E2区进行丙氨酸扫描突变分析， 将4株单克隆抗体HC33.4、HC33.8、HC33.29、HC33.1.的HC表位限定于aa 411~446, 实验表明， 这些单克隆抗体与位于L413、G418和W420处的残基无法结合。在此基础上， KECK等[38]对E2区域的aa 384~466 （包含了完整的高变区1的范围） 进行丙氨酸扫描突变， 将E2突变体在HEK293T细胞中表达后， ELISA法检测与4种单克隆抗体的结合情况， 结果表明， 4株HC33相关单克隆抗体与L413A、G418A和W420A突变体的结合降低了80%以上；其中3株抗体与K408A突变体的结合降低80%, 另1株抗体与K408A突变体的结合未见明显降低。从而得出结论：这4株抗体可被分为两类。
6 HDX-MS
HDX-MS是一种研究蛋白质-配体相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用的方法[39], 该方法的基本原理是：将蛋白质浸入重水中， 蛋白质表面与重水密切接触的氢比蛋白质内部的氢交换速率快， 一旦两种蛋白质彼此绑定， 溶剂就无法接触到其相互作用的界面。将该原理反映至氢氘交换动力学上， 通过质谱即可得到结合或不结合单克隆抗体时抗原包含的氘量。尽管该方法的应用存在一些变化， 但主要包括6个步骤：用包含氘的溶液处理抗原、处理好的抗原与目的抗体结合、水洗氘-抗原-抗体混合物以进行离子交换、用低p H缓冲液洗脱抗体、抗原洗脱后经胃蛋白酶消化、质谱检测[40].检测结束后， 用生物信息学的方法分析包含了氘的抗原片段， 在蛋白质数据库中找到与抗原晶体结构一致的构型。
f Hbp是脑膜炎双球菌的关键毒力因子， 其在脑膜炎球菌的发病机制中起重要作用， 可将人类因子H （hf H） 招募至细菌表面以保护细菌不经补体介导而死亡。MALITO等[41]通过HDX-MS分析f Hbp与其单克隆抗体12C1的结合表位， 结果显示， 在12C1存在时， 19个f Hbp片段中， 7个的H-D交换发生减少。这些部分重叠肽可定义4个不连续区段， 包含了分布在f Hbp N和C-末端结构域的92个残基， 并聚集在不同区域。PRADZIN′SKA等[42]通过HDX-MS分析了人半胱氨酸蛋白酶抑制剂C （h CC） 单体蛋白与其单克隆抗体Cyst10及Cyst28结合的情况， 结果显示， Cyst10识别分别位于h CC两个环装结构的两个片段；Cysr28识别的表位分为4个部分， 其中3个片段位于β股内， 第4的片段包含了L1环的序列。
7 生物信息学表位预测
近几年， 基于生物信息学的表位预测显着促进了疫苗的发展， 也有许多预测软件已成功在病毒表位预测中使用。表位根据其受体的不同分为两类：一类为T细胞表位， 由T细胞受体识别；另一类为B细胞表位， 由B细胞或抗体识别， B细胞表位分为连续的线性表位和非连续的构象表位， 且以构象表位为主。与T细胞表位预测相比， B细胞表位预测更复杂， 尤其是构象表位， 除了序列之外， 还要考虑蛋白质的3D结构。在本文中主要阐述与单克隆抗体表位分析相关的B细胞表位预测。
表位预测方法中最基本的假设是：同种病毒中存在进化关系， 且序列分析可发现其中保守序列或结构。已开发的预测算法均是基于抗原的主要氨基酸序列、3D结构或蛋白特性诸如亲水性、易接近性和柔韧性。预测工具[43]主要有以下几种：e Pitope、Bcepred、ABCpred、Discotope、Bepi Pred及CEP等， 每种软件在精确性、特异性和敏感性方面有所不同。
MAHDAVI等[44]用生物信息学的方法预测了人类表皮生长因子2胞外结构域子域Ⅲ （HER 2ECD-SubdomianⅢ） 的B细胞线性和构象表位， 该研究首次对HER 2 ECD-SubdomianⅢ新的B细胞构象表位进行了鉴定。使用了ABCpred、BCPREDs、Bepired、Bcepred和Elliprro来预测线性表位；Discotope、CBtope和SUPERFICIAL对构象表位进行预测。DENISOVA等[45]同时应用突变分析和表位预测来研究抗西尼罗病毒 （West Nile virus） E蛋白单抗识别的表位， 实验中， 两种方法展现了良好的互补性， 为表位特征描述提供了稳固的平台。
由于这些预测方法是经电脑模拟， 省时且成本低， 常作为抗原表位鉴定的辅助工具在详细实验研究前使用。当使用此类方法时， 要认识到当前软件的局限性， 人们对免疫系统认知不完全和预测方法的近似性致使不可能存在一种精确的算法， 另外， 不同的工具也许会产生不同的结果， 应使用多种预测工具来确保结果的一致性。
8 小结
目前， 单克隆抗体主要用于癌症治疗、自身免疫疾病的免疫调节治疗、移植排斥反应和移植物抗宿主疾病等， Daratumumab是一种新的高亲和力的治疗性单克隆抗体， 用于治疗多发性骨髓瘤， 其以独特的CD38抗原表位为靶分子， 丰富的临床前数据支持了其在联合治疗中的使用， 且各种组合使用的临床研究正在进行中[46].Tregalizumab是第一个人源化抗CD4单克隆抗体， 能选择性诱导调节性T细胞 （Tregs） 的活化， 与CD4上一个独特表位结合， 用于治疗类风湿性关节炎[47].IWAMOTO等[48]通过细胞结合试验分析， 得出抗肝素结合表皮生长因子 （HE-EGF） 单克隆抗体2-108识别HB-EGF的N-末端前导肽区域， 结果表明， 该单克隆抗体将在HB-EGF相关癌症的诊断、基础和临床研究中发挥作用。单克隆抗体也将用于感染性疾病的治疗， 包括真菌感染和细菌感染[49], 考虑到抗感染药物使用广泛， 易造成毒副作用， 因此选择靶向微生物病原体的药物是研究和临床应用的关键。
单克隆抗体是目前临床使用量增长最快的治疗药物之一， 适应证广泛， 尽管如此， 与传统的多克隆抗体制剂相比， 单克隆抗体的效力仍相对较低， 另外， 仅用一种中和性单克隆抗体， 其效力可能会由于表位的突变受到抑制。为提高用药效力、扩大特异性， 还可将对靶抗原有不同特异性的单克隆抗体进行混合， 这种混合单克隆抗体可能会出现协同作用， 其效力超过每种单克隆抗体效力之和。这需对不同的单克隆抗体进行表位分析来判断其结合的表位是否相同， 甚至完全明确其结合的表位序列。单克隆抗体鸡尾酒药物CL184由两种针对不同表位的单克隆抗体混合而成， 用于狂犬病的暴露后预防[50], 另外， 还有一些处于研究阶段的此类药物， 包括用于流行性感冒[51]、炭疽[52]和癌症[53]等。ZMappTM由3种单抗混合， 这3种单抗分别结合埃博拉病毒 （Ebolavirus, EBOV） GP抗原的不同表位， 数个病患用药后身体状况得以改善[54-56].单克隆抗体作为治疗和诊断使用须进行仔细的筛选， 以筛选出识别目标抗原特定表位的抗体， 这样使抗体达到预期生物功能[57].
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