不同抗原修复方法对食管癌免疫组化染色的影响

　　免疫组化染色主要通过利用抗原抗体特异性反应，对细胞或组织内抗原物质作定位或定性标记的方案，其操作相对简单，且灵敏度、特异性均比较高，在临床病理诊断中有较高的应用价值。但有研究表示，在病理诊断中常用的福尔马林来固定石蜡包埋组织，通常可能产生蛋白交联反应，对组织、细胞内部某些蛋白抗原可能产生遮蔽影响，阻断了抗体与抗原之间的结合，为充分暴露被封闭的抗原，一般需使用抗原修复技术[1].且研究显示，不同抗原修复方法可能对免疫组化染色结果产生直接性影响[2].基于此，为分析不同抗原修复方法对食管癌免疫组化染色的影响，本文作者选取 4种不同抗原作染色标记，并选用微波及高压抗原修复方案作对比研究，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　于我院病理科收集食管癌组织标本 12 例。所有组织标本均经福尔马林固定，石蜡包埋，并连续切片，厚度为4um,放于载玻片内，在温度为 50 ℃烤箱内过夜，避免脱片。

　　1.2 仪器与试剂

　　仪器：微波炉 1 台，压力锅 1 只，电磁炉 1 台。试剂：CD4（1:40），鼠抗人 CD4T 细胞单克隆抗体。CD8（1:250），兔抗人单克隆抗体。IL17（1:500），羊抗人 IL17 抗体。

　　Ki67（1:100），兔抗人单克隆抗体。枸缘酸盐 CB,PBS 磷酸盐缓冲液，试剂盒。

　　1.3 方法

　　将组织切片放入二甲苯内作脱蜡处理，使用梯度乙醇作水洗处理，放于过氧化氢中，浸泡 10 min,清除过氧化物酶活性。抗原修复。（1）高压修复法。将 2000 mL 左右的柠檬酸盐缓冲液放入高压锅，使用电磁炉将其煮沸，导入耐高温塑料切片架，脱蜡水化后，将组织切片缓慢放入高压锅，使其位于液面下，随后加热，待高压锅盖开始喷气，控制加热时间为 15 min,关闭电磁炉。将高压锅放于水下冷却冲洗5 min,打开锅盖，继续冷却。随后使用 PBS 缓冲液冲洗，使用试剂盒作抗体孵育，作 DAB 显色，复染，封片。（2）微波修复。在微波盒内倒入柠檬盐酸缓冲液，将其放于耐高温塑料切片架，脱蜡水化，将组织切片放于缓冲液内，使用微波高火 5 min 后转中低火，25 min 后取出，放于室内自然冷却，时间为 10 min,后冲水冷却 15 min.

　　1.4 评价标准

　　阳性：CD4、CD8 细胞膜出现棕黄色信号，IL17 细胞浆出现弥漫性棕黄色信号，Ki-67 细胞核出现棕黄色信号。

　　阳性程度评分标准：0 分：不着色；1 分：深棕黄色；2 分：棕黄色；3 分：深棕色。阳性信号评分。0 分：阳性细胞百分率 0 % ~ 5 %;1 分：5 % ~ 25 %;2 分：25 % ~ 75 %;3 分：>75 %.综合两项总分将细胞阳性程度分作四级。阴性（-）：0 ~ 1 分；弱阳性（+）：2 ~ 3 分；阳性（++）：4 ~ 5 分；强阳性（+++）：6 分。

　　1.5 统计学方法采用 SPSS 18.0 软件进行数据处理，计数资料用百分比表示，采用 χ2检验，P < 0.05 为差异具有统计学意义。

　　2 结 果

　　高压抗原修复方法，CD4 抗体阳性率为 100.0 %,明显高于微波修复的45.5 %,两种方法比较，差异有统计学意义（P< 0.05），CD8、IL17 及 Ki67 抗体阳性率比较，差异无统计学意义（P > 0.05），如表 1.【1】

　　
　　3 讨 论

　　免疫组化染色的质量受到不同因素的影响，其中抗原修复是其关键影响因素[3].非正常、不当修复是导致其出现假阴性及假阳性结果的主要原因。通常来说，病理标本一般采用浓度为10 %的福尔马林液作固定处理，在其固定过程中，蛋白质分子交联也在不断增加，导致抗原决定簇封闭，影响了免疫组化反应结果的表达[4].而抗原修复则是通过高温或高频电波作用，将醛链打开，促使抗原充分暴露，以达到组织修复的作用。但当前临床上有较多研究者对高压及微波两种修复方法在免疫组化染色中的影响判定尚且存在一定的争议[5,6].

　　本文作者主要以食管癌组织为标本，分别使用两种抗原修复方法作抗原修复处理，结果证实，高压抗原修复中，CD4 抗原阳性率为 100.0 %,明显高于微波修复的 45.5 %,差异有统计学意义（P < 0.05）。但其他 3 种抗原修复效果对比差异无统计学意义。但一般高压修复条件相较微波修复而言更为剧烈，部分肿瘤组织在修复过程中可能出现脱片现象[7].因而，一般建议，对部分染色阳性率无明显差异的抗原而言，提倡采用微波修复方案。

　　综上，在食管癌组织表达免疫组化实验中，CD4 抗原的修复以高压抗原修复方法阳性率高，修复好。因此，在组织不脱片的条件下，采取高压抗原修复方案，操作相对简单，且结果比较稳定，可操作性强，重复性好，定位清晰，背景着色浅，非特异性着色弱。但同时还需注意在高压修复过程中，较易出现肿瘤组织脱片现象，在两种修复方法阳性率对比无差异的条件下，建议尽可能选择相对柔和的微波修复方法。

　　〔参考文献〕
　　
　　〔1〕 陈余朋 , 张声 , 王行富 , 等 . 不同的抗原修复方法在Ⅳ型胶原免疫组化染色中的应用〔J〕。 临床与实验病理学杂志 ,2014,30（1）：98-100
　　〔2〕 宿颖 , 刘曼 , 张辛燕 . 不同抗原修复方法对 KLF4 在小鼠舌黏膜上皮中表达的比较〔J〕。北京口腔医学，2014,14（6）：344-346
　　〔3〕 张富军 , 任娟 , 王飞苗 , 等 . 核受体免疫组织化学染色时抗原修复方法的选择〔J〕。西安交通大学学报：医学版，2010,31（2）：252-254
　　〔4〕 熊正文，李伟，黄勇，等。光波/微波组合-EDTA修复COX-2抗原及其在乳腺癌的表达及意义〔J〕。 中国组织化学与细胞化学杂志 ,2010,19（6）：572-578
　　〔5〕 李文琴 , 万国兴 , 李锋 , 等 . 乳腺癌组织 Slug 和 Snail 细胞核抗原热修复方法的优化〔J〕。临床与实验病理学杂志，2014,30（7）：809-810
　　〔6〕 刘海洋 , 王效军 , 张海宇 , 等 . 微波加热修复和盐酸水解修复方法对大鼠脑组织免疫组化染色结果的影响〔J〕。 宁夏医科大学学报 ,2011,33（11）：1115-1116
　　〔7〕 蒋洁 , 贺志飞 , 蓝永洪 , 等 . 免疫组化染色中核抗原暴露的优化〔J〕。 海南医学院学报 ,2013,19（6）：728-730,734