结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis, Mtb）感染引起的慢性传染性疾病。结核病在全球范围内仍有着较高的发病率和死亡率。据WHO报道，全世界约有三分之一的人群被感染，每年约有800万新病例发生，至少有200万人死于结核病[1].结核病的治疗，包括多药物联合治疗，至少需要持续6个月，易对肝脏造成损害，并伴有其他副作用[ 2 ].多耐药菌株（MDR），尤其是广泛耐药菌株（XDR）的出现，给结核病的治疗带来日益严峻的挑战[3].
卡介苗（Bacille Calmette-Guerin, BCG）是目前用于预防结核病的唯一疫苗，自发现以来接种达40亿剂[1],但并不能有效控制结核病的传播。目前研究结果表明，卡介苗免疫保护力只能维持10~15年[4].因此卡介苗对新生儿有较好的免疫保护效果，能降低儿童重症结核病的发病率，但对成人肺结核的保护效果并不明显[3].基于卡介苗在成人中保护效力下降的现状，结核病新型疫苗的研制和免疫策略的优化显得格外重要。通过抗结核黏膜免疫应答机理的深入研究，增强机体对Mtb的黏膜局部和全身免疫应答的认识，有望使黏膜免疫疫苗成为结核疫苗研发的新策略。
本综述将围绕目前宿主抗结核黏膜免疫的研究进展，重点介绍黏膜免疫在结核疫苗研发中的作用和研究进展。
1 黏膜免疫应答与抗结核感染
黏膜免疫系统（mucosal immune system, MIS）是指由黏膜相关淋巴组织所组成的免疫系统。人体的黏膜面积达400平方米，黏膜免疫系统拥有人体80%的免疫细胞[5],是抵御病原微生物的第一道防线。研究发现黏膜免疫能够同时激发黏膜局部和全身免疫应答[6].Woof等[7]发现在黏膜组织的免疫反应可能会导致其他的黏膜表面产生IgA抗体。这与在局部黏膜部位活化的B细胞还可以进入血液循环，迁移至远处黏膜组织，并定位于该黏膜部位有关[8].
Mtb主要通过呼吸道传播，由于呼吸道中存在大量的黏膜相关淋巴组织，黏膜局部免疫诱导的抗结核保护性免疫效应相对于其它部位更为快速和有效[9].Mtb进入呼吸道后，广泛分布于呼吸道黏膜中的树突状细胞（dendritic cell, DC）作为最主要的抗原提呈细胞（APC），在摄取、递呈抗原后可以激活T细胞，并辅助B细胞产生IgA[10].同时在Mtb感染中，树突状细胞也可以发挥吞噬细菌、激活T细胞、分泌IFN-γ的作用[11].Vordermeier等[12]发现，黏膜局部B细胞可以产生抗Mtb的体液免疫应答。B细胞通过表面多种表面分子（如BCR、CD40等）接受Mtb抗原刺激后，发生活化和分化为IgA产生细胞。IgA是黏膜免疫应答的重要特征性效应分子，其水平的高低是反应黏膜免疫是否强大的有效指标之一[13].Dullaers等[14]研究表明，黏膜局部IgA的产生细胞来源于生发中心，并在滤泡辅助T细胞（T follicular helper cell, Tfh）的辅助下产生，生发中心中的Tfh通过分泌TGF-β1和IL-21促进IgA抗体产生细胞的分化，并通过上调CCR10促进IgA浆母细胞归巢到黏膜局部，分泌具有免疫保护作用的sIgA.
T淋巴细胞被认为是黏膜免疫中最主要的免疫效应细胞，占黏膜部位淋巴细胞总数的80%[13].机体感染Mtb后，黏膜中CD4+T细胞产生的IFN-γ能够激活巨噬细胞，这是控制和消除Mtb的关键[15]CD8+T细胞可以参与被感染细胞的溶解与凋亡，也能杀伤细胞内的结核杆菌[16].树突状细胞和被激活的巨噬细胞释放的IL-12、IL-18等可以进一步诱导自然杀伤细胞和各种T细胞的活化，协同杀死细菌[17].研究发现，黏膜相关恒定T细胞（mucosal-asso-ciated invariant T cell, MAIT）在宿主抗结核过程中可能也发挥着重要的生理作用。虽然还没有来自于结核病患者黏膜局部的数据，但是Jiang等[18]研究发现，活动性肺结核患者的MAIT细胞在活动性结核病患者外周的数量明显低于正常人群，并且其细胞表面程序性死亡-1（programmed death-1, PD-1）的表达明显上调，表明活动期患者体内MAIT的数量不仅下降，同时可能功能也受损。
2 黏膜免疫与结核疫苗
接种疫苗是预防疾病的主要手段之一。疫苗能在使用后产生保护性免疫，待病原体感染时通过免疫记忆细胞的增殖快速免疫应答，产生效应细胞和效应分子。但目前正在研发的大多数候选疫苗，绝大部分属于全身给药，它们可以诱导很强的全身性免疫应答而忽略了黏膜局部免疫应答的保护作用。在抵御经由呼吸道传播病原菌中，诱导局部及全身黏膜免疫应答，可通过黏膜进行接种，使疫苗发挥前哨的保护作用。Mtb在感染过程中首先经过黏膜播散，所以通过黏膜局部疫苗的使用，在黏膜局部产生有效的抗结核保护作用对于肺结核的防治也至关重要[19].通过黏膜免疫增强免疫保护作用的研究已有报道。如Shim等[20]研究发现，通过黏膜途径接种流感疫苗，尤其是通过滴鼻途径在黏膜和血清中可以诱导产生较高的IgA和IgG抗体水平。在结核疫苗研究中，Pepponi等[21]在小鼠呼吸道黏膜内注射Ag85B-Acr-RICs疫苗时，其特异性抗体和T细胞应答水平，包括抗原特异性T细胞产生IFN-γ的水平显着提高。Doherty等[22]在小鼠和猪体内通过胃黏膜接种ESAT-6-Ag85B-MPLSE疫苗后，在脾脏内IFN-γ的产生水平明显增高，而且体内结核菌落的数量显着减少。
目前，研究比较深入的各类结核疫苗有减毒活疫苗、重组卡介苗疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等。这些疫苗的研发过程中首先考虑的是皮下或是肌肉免疫途径，忽视了黏膜免疫在免疫应答中的积极作用。选择高效的免疫途径、良好的佐剂和递送系统是黏膜疫苗有效激发诱导黏膜局部和全身免疫应答的不可或缺的因素。
2.1 黏膜免疫途径
黏膜免疫途径，主要包括口服（胃肠道）途径和鼻腔免疫（上呼吸道）途径。鼻腔作为呼吸道的重要环节，生理环境温和，抗原诱导免疫反应的阈值较低，能够避免胃肠道的酸性环境及酶的作用对疫苗成分的破坏，故鼻腔免疫所需要疫苗的量较小；同时鼻黏膜上覆盖有大量的树突状细胞，具有摄取抗原的先天优势。而且人体鼻咽相关淋巴组织（NALT）具有抗原保留隐窝，而肠相关淋巴组织（GALT）不具备这样的结构，所以鼻腔免疫途径的免疫有效性优于口服途径[23].
已有研究发现，通过使用腺病毒基因载体携带结核分枝杆菌蛋白Ag85A进行鼻腔内免疫强化，可以提高Ag85A抗原特异性T细胞在肺部及呼吸道内的记忆功能，协同增强卡介苗免疫接种对肺结核的保护作用[24].通过鼻内途径，运送含有结核分枝杆菌抗原蛋白FbpA和HtpXd DNA的非致病菌可以诱导抗原特异性T细胞应答，并防止结核分枝杆菌的入侵[25].除此以外，Ag85B-ESAT-6蛋白通过鼻内接种疫苗途径，可以降低结核分枝杆菌在肺内的感染几率[26].编码HSP65的DNA疫苗通过鼻免疫途径能够对结核分枝杆菌产生保护性免疫反应[27].Chen等[28]研究发现，与皮下注射疫苗相比，在通过鼻黏膜途径接种疫苗抵御Mtb的时候，BALB/c小鼠的脾脏中产生更多的IFN-γ，并且肺部T细胞能够更迅速地活化、增殖。Hoft等[29]在由卡介苗诱导的小鼠的鼻黏膜内接种Ad35后，机体诱导出的CD4+T细胞和CD8+T细胞的浓度高于皮下接种。Lyadova等[30]通过鼻黏膜途径给小鼠接种卡介苗5周后，发现肺部总T淋巴细胞数和CD4+T细胞数都显着增加，同时T淋巴细胞在抗原诱导下产生IL-5、IL-12、IFN-γ的数量显着增加。
上述动物实验研究表明结核疫苗鼻内免疫接种后不仅可以诱导黏膜局部的特异性免疫应答，同时还可以诱导肺部的特异性免疫应答，有效清除肺部病原菌。鼻内免疫途径对黏膜局部和全身抗结核免疫应答都可以产生增强作用，在肺结核的防控的积极意义显而易见，有望成为预防Mtb感染的有效策略。
2.2 黏膜免疫用佐剂
佐剂本身不具备抗原性，但是可以非特异性地增强机体对抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答的格局，诱导更加有效的体液和细胞免疫应答[31].同时，佐剂的使用还可以解决黏膜免疫途径易诱发免疫耐受、免疫应答减弱、持续时间缩短等问题[24].Dietrich等[32]研究发现，与无佐剂接种卡介苗相比，使用双十八烷基二甲基溴化铵（DDA）作为卡介苗的免疫佐剂时可出现更明显的T细胞免疫应答，增加抗结核效应。目前，已经有有效改善免疫应答的佐剂相继被用于黏膜免疫疫苗的研制，包括有细菌毒素、CpG基序、免疫刺激复合物等。
细菌毒素中最主要的是霍乱毒素（cholera toxin,CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat labile enterotoxin,LT），能提高抗原呈递细胞（APC）呈递抗原的能力[33].霍乱毒素可诱导树突状细胞分泌IL-1β，还可通过上调IL-10,下调IL-12,选择性地影响细胞表面分子的表达，增强T细胞的调节活性[34].不耐热肠毒素最大的优点是毒性较霍乱毒素低，可诱导产生IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3和黏膜sIgA,同时诱导Thl型和Th2型应答[33].但是霍乱毒素和不耐热肠毒素具有的生物毒性阻碍了在人体中的应用，限制了其作为黏膜佐剂的广泛使用。近年来CpG（Cytosine-Phosphate-Guanosine,CpG）基序作为佐剂的潜力也已得到广泛认可。
CpG基序又称DNA免疫激活序列，是一些以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基序的寡脱氧核苷酸短序列，可诱导多种免疫细胞分泌各种细胞因子、诱导B细胞分泌免疫球蛋白、激发非特异性免疫应答、诱导Thl免疫应答并抑制Th2免疫应答等，被认为是一种安全有效的佐剂[35].Blazevic等[36]发现，鼻内接种Ag85B/CpG后，高免疫原性的Ag85B在CpG的辅助下能更多地进入到肺内和黏膜皮下组织，并可以有效防止局部黏膜感染，该疫苗可以两周内在老鼠的呼吸道内诱导出CD4+Th1和CD8+T细胞。
同时，通过基因工程方法获得含有内置分子佐剂的新型疫苗在结核疫苗的研发中得到初步应用。如Pepponi等[21]采用基因工程方法在烟草中表达Ag85B-Acr-抗Acr单克隆抗体重链（TB-RICS）多肽链，该多肽链可以通过重链自发形成二聚体，纯化后的蛋白质经滴鼻免疫后在小鼠体内起保护性作用。这些结核分枝杆菌抗原-重组免疫复合物可以直接结合补体分子，也可以与APC细胞直接结合，从而激发有效的免疫应答。
此外，免疫刺激复合物（immune-stimulatingcomplex, ISCOM）作为另外一种新型疫苗，是蛋白质抗原的脂类载体复合物，通过促进免疫细胞对抗原的摄取，进而促进机体的黏膜免疫应答。An-dersen等[26]研究报道，小鼠接种DNA疫苗时，在佐剂CTA-1DD/ISCOM的帮助下，CD4+T细胞分泌的IFN-γ的水平显着增加，提高抗结核应答能力。
2.3 黏膜免疫抗原递送系统
黏膜递送系统的主要作用是保护抗原，使之免受呼吸道黏膜、胃肠道黏膜或其他部位的酶降解，从而增强机体对抗原的免疫应答。黏膜递送系统还具有抗原缓释作用，通过延长抗原的释放时间、避免突释效应、维持抗原有效浓度来加强机体产生持续长效的免疫保护作用。目前研究较热的递送系统有脂质体、病毒体和病毒样颗粒、壳聚糖及其衍生物等。
脂质体作为常用的经鼻免疫载体递送系统，可以增强IgG和局部IgA的应答。Okada等[37]报道与单独卡介苗的免疫效果相比，Hsp65+IL-12/HVJ-脂质体DNA疫苗能在小鼠和豚鼠体内更迅速地诱导Hsp65特异性的CD8+T细胞，并增强IFN-γ的分泌。病毒体是一种含有功能性病毒膜蛋白的脂质体，例如免疫增强重建流感病毒体（IRIV）[38].病毒体表面通过偶联抗原，模拟自然感染的途径，介导多种免疫细胞活化，增强免疫应答。McShane等[39]通过小鼠试验，发现痘病毒载体疫苗MVA85A能成功增加卡介苗接种后的免疫应答。同样地，San-tosuosso等[40]报道，腺病毒载体疫苗AdAg85A也能够增强既有卡介苗的免疫应答。
壳聚糖作为一种新的递送系统，在经鼻免疫中的作用也不可小觑。壳聚糖有延长疫苗作用时间、维持产物有效浓度、减轻不良反应等优点。Amidi等[41]研究报道，壳聚糖可以通过蛋白激酶C打开细胞间紧密连接，提高黏膜通透性，促进肽类分子的跨黏膜吸收。Bolhassani等[42]报道，以壳聚糖作为蛋白疫苗的递送系统可以靶向APC细胞，激活CD8+T细胞，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）应答。
基因工程技术的进步也带动了黏膜递送系统的研发。通过基因工程方法构建的活重组细菌和病毒载体，具有表达目的抗原、少毒甚至无毒、能增殖和入侵黏膜表面的优点。所以，将活的重组病毒或是细菌作为抗原的递送系统，既可以提高免疫应答的持久性，也可以获得免疫效果的多样性。重组病毒载体目前研究较多，Watanabe等[43]人通过视黄酸Ⅰ型受体诱导基因，用表达Ag85B的重组Ⅱ型人类副流感病毒（rhPIV2-Ag85B）鼻内接种老鼠，可以诱导抗原特异性黏膜免疫应答，免疫效果优于普通的Ag85B免疫应答。
近年来，惰性细菌孢子（inert bacterial pore）作为一种新开发的载体系统，在经鼻免疫中的作用得到较广泛的研究。Reljic等[3]将表达结核特异性抗原的惰性细菌孢子，鼻内接种小鼠，可以诱导体液和细胞免疫，并诱导产生各种功能的T细胞，能大大减少感染老鼠肺部和脾脏的结核菌落。
还有研究发现，由各种比例的脂类分子和蛋白质组成的脂蛋白所形成的纳米颗粒，一方面对抗原有保护作用，同时可以增加黏膜疫苗的有效性。Stylianou等[44]运用肝素结合血凝素黏附蛋白（HBHA）的保护，减少Ag85B抗原在经过肺泡上皮过程中被酶降解的数量，提高了抗原浓度。结果表明，通过鼻内接种表达Ag85B抗原的肝素结合血凝素黏附蛋白（Ag85B-HBHA），能够诱导小鼠产生持续性的体液免疫应答和CD4+T细胞，增强IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌。
3 展望
抗结核黏膜免疫应答不仅成为抵御结核菌感染的第一道防线，黏膜局部所产生多种免疫效应分子对于激发结核菌感染脏器甚至全身免疫应答都具有重要的免疫调控作用，由此提出的黏膜免疫疫苗也成为结核疫苗研制的新策略。同时，黏膜疫苗接种还具有接种方便，不需要注射器，容易被大众接受，接种成本低等优势。通过寻找免疫原性更强的抗原、合适的黏膜疫苗接种途径、高效的黏膜免疫佐剂和抗原递送系统，是研发获得黏膜免疫疫苗的关键。在结核黏膜疫苗的研发中，综合结核抗原的筛选和其他呼吸道感染疫苗研发的最新进展，会使结核黏膜免疫疫苗从实验室走向实际应用成为现实，为结核病及其他黏膜感染性疾病的防控提供新的手段。
参 考 文 献
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