人组织激肽释放酶( TK) 作为人激肽释放酶-缓激肽( KKS) 系统中的一个关键酶,能通过裂解低分子量激肽原释放缓激肽和激肽类物质,进而与血管壁和其他部位的内皮平滑肌细胞上的缓激肽受体 2( B2) 结合,激活一氧化氮-环磷酸腺苷( NO-cAMP)和前列环素-环磷酸腺苷( Prostacyclin-cAMP) 等信号通路,触发一系列生物活性效应,包括血管舒张、平滑肌收缩和舒张、抑制凋亡、炎症、增殖、肥大和纤维化,及促进血管生成和神经发生等[1,2].由于 B2 受体广泛存在于人体内的组织及细胞中,如平滑肌细胞、神经细胞、肾小管上皮细胞和心肌细胞中[3],因此 TK 具有广泛的生物效应并可能在心脑血管疾病的发生发展中具有广泛的应用前景.本研究利用生物信息学预测 TK 蛋白可能的高级结构、亲水性和抗原性高低,根据分析结果,选取预测抗原性较高、与已知蛋白同源性低的多肽片段,将其免疫家兔,制备针对 TK 不同抗原表位的多克隆抗体,为 TK 检测试剂盒的制备以及进一步研究 TK 在心脑血管疾病发生发展的作用及机制奠定了基础.
1 材料与方法.
1. 1 主要材料 日本大耳白( 2 kg) 购自华中科技.
大学同济医学院实验中心; 血蓝蛋白( KLH) 、戊二醛、弗氏完全佐剂( FCA) 、弗氏完全佐剂( FIA) 、TMB 购自 Sigma 公司; 牛血清白蛋白 ( BSA) 、甘氨酸、HRP 标记羊抗兔 IgG 购自武汉凌飞生物有限公司; 抗体亲和层析试剂盒购自 PIERCE 公司; TK-4T1融合蛋白为本实验室生产[4]; 预染的蛋白质分子量标准购自 Fermentas( MBI) 公司; PVDF 膜购自德国Schleicher&Schuell 公司; 化学发光试剂 ECL 购自PIERCE 公司; 凝胶成像系统( Gene Genius Bio Ima-ging System) 为 Synegene 公司产品; Western blot 设备为 Biorad 公司产品.
1. 2 生物信息学分析 登录进入采用 Blastn 和 Blastx 程序,进行同源性检索和保守性分析.采用 ProtScale 程序、ExPASy工具包程序、SWISS PROT 蛋白数据库和 DNA star( Protean) 生物信息学软件对 TK( KLK1) 的二级结构、抗原性、亲疏水性、结合位点、氨基酸的带电性等理化性质进行分析.
1. 3 TK 多肽的设计与免疫原及包被原的合成.TK 是位于人类染色体 19q13. 13 ~ 19q13. 14 上的一段丝氨酸蛋白酶( 图 1) ,由 262 个氨基酸组成.我们根据生物信息学分析和预测,按抗原性、亲疏水性和同源性分析,分别设计了位于 TK 头端的含 11 个氨基酸的多肽 ( 11P: AC-Glu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-Ala-Asp-Glu-Asp-Thr-COOH) 和位于 TK 尾端含 12个氨 基 酸 的 多 肽 ( 12P: NH2-Cys-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser-COOH) ( 图 2 ) . 多肽的合成和纯化由西安美联公司完成( 纯度为 98%) .
首先称取 10 mg 多肽溶于 1 ml PBS,取其中 700 μl置于 10 ml 试管中,分别加入 1 ml KLH 及 BSA,然后缓慢加入0. 3%戊二醛,室温下振摇2 h 直至反应液变为黄色,加入 1 mmol/L 甘氨酸 125 μl 终止反应.30 min 后将所有反应液体装入透析袋内,并将透析袋置于 2 L PBS 中,在 4℃充分透析,隔日更换PBS 继续透析 4 h.分装包被原 ( 11P-KLH; 12P-KLH) 及反应原( 11P-BSA; 12P-BSA) ,- 20℃ 保存.
1. 4 TK 多克隆抗体的制备及纯化 分别取多肽免疫原( 11P-KLH; 12P-KLH) 与等量弗氏完全佐剂充分乳化,按 300 μg/只的剂量对家兔进行背部皮内多点注射,3 周后,将免疫原与等量弗氏不完全佐剂充分乳化,并用同样的方法免疫小鼠,以后每隔 3 周免疫 1 次,共免疫 3 次.末次免疫后 7 d 于耳缘静脉取血,试血达理想效价后颈动脉放血,收集兔血清并进行亲和层析纯化.
1. 5 TK 多克隆抗体效价及抗原表位分析 利用间接 ELISA 法来测定 TK 兔抗血清的效价.以包被原为固相,加入倍比稀释的兔抗清及 HRP 标记的羊抗兔抗体,以1∶ 200稀释的正常兔血清作为阴性对照,应用间接 ELISA 方法以 TMB 为底物测定 OD450nm值,以( 被检标本值 - 空白对照值) /( 阴性对照值 -空白对照值) 即 P/N ≥2. 1 为阳性.采用间接ELISA 相加实验进行测定.以 TK-4T1 融合蛋白为抗原包被酶标板,前两孔分别加入上述两种多抗( 抗11P 及抗12P) ,其 OD 值分别记录为 A1 和 A2,第 3 孔先以其中一种饱和量的多抗于 37℃ 作用 1h,洗涤后再与另一种多抗作用 1 h.洗涤后,加入HRP 标记的羊抗鼠 IgG,于 37℃ 保温 30 min,洗涤后加 TMB 显色,A450 值记录为 A1 +2,计算相加指数:AI =[2A1 + 2 / ( A1 + A2 ) - 1] × 100% .每组 做 3 个复孔,取其平均值.AI >50% 者,即认为这两种多抗识别 TK 不同的抗原表位.
1. 6 TK 多克隆抗体的特异性及纯度检测 我们将TK-4T1 与纯化后的 TK 多克隆抗体行 Western blot检测以鉴定多克隆抗体的特异性.然后利用 SDS-PAGE 检测多抗的纯化效果.
2 结果.
2. 1 多肽抗体的制备和效价 家兔免疫后获得的血清进行倍比稀释,以 P/N≥,2. 1 为阳性,间接ELISA 测定效价均达 1∶ 25 600 以上,表明获得高效价的多抗.
2. 2 抗原表位分析 经间接 ELISA 法检测,A1 的均值为 0. 79,A2 的均值为 0. 92,A( 1 +2) 的均值为1. 58; 抗 11P 与抗 12P 的相加指数为 0. 85% ,其值大于 50%.因此抗 11P 与抗 12P 识别不同的抗原表位.
2. 3 多肽抗体的特异性 为了检测兔血清的特异性,我 们 分 别 将 TK-4T1 融 合 蛋 白 和 阴 性 对 照PEGX-4T1 转印至 PVDF 膜上,然后将分别将纯化后的抗体稀释到 1∶ 8 000 倍进行 Western blot 印迹分析,结果均显示转印至 PVDF 膜上的 TK-4T1 蛋白与免疫兔血清在 Mr 约55 kD 处形成单一阳性染色带,与 TK-4T1 蛋白分子量的理论值相符,而阴性对照处则无条带出现,表明获得了抗 TK 的多克隆抗体( 图 3) .
2. 4 多肽抗体的纯度 利用亲和层析法分别纯化了抗 11P 与抗 12P,并采用回收的抗体样本做了SDS-PAGE 染色,结果均发现了清晰的两条带( 轻链和重链) 且未见杂带.因此,该抗体的纯化率为100% ( 图 4) .
3 讨论.
人组织激肽释放酶是一类丝氨酸蛋白酶,位于人类染色体 19q13. 13 ~ 19q13. 14 上,因编码不同的丝氨酸蛋白酶而具有不同的功能.人组织激肽释放酶由 15 个成员组成.人和动物的组织激肽释放酶中只有一种酶能有效地使激肽原释放生物活性物激肽即为 TK[5].我们前期制备 TK 多抗的方法是采用构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化图 4 TK 多克隆抗体经亲和层析纯化后的 SDA-PAGEFig. 4 SDA-PAGE of affinity chromatography for poly-clonal antibodiesNote: M. Protein marker; 1. Anti-11P; 2. Anti-12P.
融合蛋白( TK-4T1) ,随后免疫动物制备抗血清[4].鉴于利用融合蛋白制备抗体的过程繁琐,费时费力,特异性不理想,不利于我们进一步进行 TK 相关的临床研究.因此我们利用信息学在基因识别、蛋白质功能预测、蛋白质生理范围的确定、蛋白质高级结构的预测等方面的重要作用来对 TK 的抗原性、跨膜结构域、二级结构、疏水性、结合位点、氨基酸的带电性、所选择氨基酸偏碱性和偏酸性及多肽的合成难易等进行分析[6].充分评估这些因素后我们选择了针对 TK 不同表位的两条多肽来制备针对 TK不同表位的多克隆抗体.由于合成的多肽纯度均高达 98%,并且是针对 TK 一段表位的,因此其可能具有较高的效价及纯度,并具有较强的特异性.
我们的结果证实利用这两条肽段制备的多抗均具有较高的效价及较强的特异性,并且是针对 TK不同表位的抗体,经纯化后,这两种抗体的纯度均为100% .这说明我们的多抗制备是非常成功的.此外,由于这两种抗体是针对 TK 不同表位的,我们可以将这两种抗体应用于 TK 的双抗体夹心 ELISA 试剂盒的制备及其他 TK 相关临床及基础研究.汪道文教授的团队及和 Lee Chao 等人通过使用转基因的方法使激肽释放酶-激肽在体内的持续供应,发现KKS 系统具有抗高血压,2 型糖尿病的胰岛素抵抗的作用及通过抑制氧化应激来发挥心血管、肾脏和中枢神经系统的保护作用[2,7].直接输注 TK 的基因或蛋白可以直接改善心功能、肾功能和神经功能而不伴有血压的降低.还有研究证明,过表达的 TK能减轻 2 糖尿病诱导的高血压和肾脏损害.此外,体外研究和动物实验均证明 TK 具有防护缺血性脑卒中的作用[2,9].我们前期的一项大规模的多中心研究亦证实血浆中 TK 的含量与脑卒中及其复发呈负相关关系,并且血浆中 TK 含量高的患者具有较长的无症状生存期[4].这一系列的研究进一步证实了 TK 在心脑血管及肾脏疾病的诊断和治疗方面可能具有广阔的应用前景,也说明了开发 TK 相关产品的潜在应用价值.总之,我们通过合成肽来制备针对 TK 不同表位的多克隆抗体不仅提供了一种简便的行之有效的方法,还为 TK 相关产品的开发以及 TK 相关基础及临床研究提供了一定的实验基础.
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