降钙素基因相关肽是一种由 37 个氨基酸残基组成的神经肽,属于降钙素基因相关肽家族[1].它是和降钙素( Calcitonin,CT) 在不同组织中由同一基因在进行基因重组后形成,在心脏和神经系统中主要转录表达成 CGRP,而在甲状腺主要转录表达成 CT.人类的 CGRP 有 α 和 β 两种分子形式,且都有生物活性.CGRP 广泛存在于中枢和外周神经系统中,并通过激活细胞膜上的 CGRP 受体的结合位点从而激活腺苷酸环化酶,促使细胞内 cAMP 水平升高而产生多种生理作用,如感觉、心血管活动、运动、睡眠、呼吸、体温调节等[2-5].同时,利用免疫组织化学观察到在硬脑膜上有大量的 CGRP 免疫反应性的神经纤维存在[6].有研究表明,侧脑室注射CGRP 能明显抑制压力的感受性反射[7],表明 CGRP在大鼠侧脑室内具有镇痛作用.脊髓以上水平,在多个与痛觉密切相关的脑区内,如中脑导水管周围灰质( Periaqueductal gray,PAG) 、中缝大核( Nucleusraphe magnus,NRM ) 、伏核 ( NAc ) 和中央杏仁核( Central nucleus of amygdale,CeA) 等 都 发 现 过CGRP 及其受体[8-10].缰核( Habenular complexes,Hb) 是在镇痛作用中非常重要的核团,存在于脊椎动物的背侧间脑,可分为内侧缰核( Medial habenular complex,MHb) 和外侧缰核( Lateral habenular complex,LHb)[11-13],而且 LHb 是杏仁核、海马、视前区等边缘系统到中脑的枢纽.有关 CGRP 在 LHb 内对大鼠痛觉调节的影响国内外尚未见报道,因此本实验通过对大鼠的LHb 微量注射 CGRP,采用热板和压板测痛仪来测量大鼠对伤害性热刺激和机械刺激所引起的 HWL,并将其作为衡量大鼠痛觉的指标,进而分析 CGRP参与 LHb 对痛觉的调节作用,可以为揭示 CGRP 在脊髓水平以上的中枢神经系统内镇痛作用的机制提供新的位点,并为 CGRP 受体激动剂和拮抗剂的临床应用提供依据.
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 动物 实验动物选用成年雄性 Wistar 大鼠( 由吉林大学白求恩医学院动物中心提供) 8 只,体重均在 180 ~250 g 之间,实验期间分笼饲养,自然光照,自由饮水与进食,饲养温度 16 ~24℃.
1. 1. 2 试剂与药品 降钙素基因相关肽( 上海强耀生物科技有限公司提供) 用生理盐水配置成浓度为 0. 875、1. 75、3. 5 和 7 nmol/μl,10% 水合氯醛,医用酒精,H2O2,亚甲基蓝,牙托粉和牙脱水等.
1. 1. 3 实验器材 智能热板仪( YLS-6B) ,电子压痛仪( LYS-3E) ,均由安徽淮北正华生物仪器设备有限公司生产.手术器械、注射器、脑立体定位仪( 深圳瑞沃德公司生产) .
1. 2 实验方法
1. 2. 1 实验前期工作 为了使大鼠熟悉测试环境,并减小实验误差,在实验开始之前需要对大鼠进行热板和压力测试训练.依据孙衍刚等[13]给出的实验方法,训练进行 5 d,每天5 轮,每轮3 次.经过训练后大鼠的 HWL 会维持在一个比较稳定的范围,热板测试大约为 3 ~ 5 s 之间,压力测试大约为5 ~7 s 之间.
1. 2. 2 核团微量注射 用水合氯醛腹腔麻醉,将大鼠的头部水平固定在脑立体定位仪上,暴露头骨,参考Watson 鼠图谱在外侧缰核定位,将不锈钢套管插入,用牙托粉和牙脱水固定,封住套管和颅骨之间的缝隙.手术后恢复2 ~3 d 后进行行为痛觉测试.进行核团微量注射前,将注射器插入套管,缓慢注射药物,每次注射后应让注射针在管里停留片刻再将之取出.
1. 2. 3 行为痛觉测试 热板测试: 热板的温度维持在 52℃( 51. 7℃ ~52. 3℃) ,将大鼠的待测后爪紧贴于热板上,并开始计时,待大鼠后爪感觉到疼痛,主动回缩离开热板时停止计时.记录注射 CGRP 和注射生理盐水对照组大鼠的 HWL.压力测试: 使用压力测痛仪对大鼠进行压力测试,用脚踩住开关,使小楔形有机玻璃压在鼠爪的跗跖关节处,待大鼠后爪感觉到疼痛时,会往回收缩,此时停止计时,记录注射 CGRP 和注射生理盐水对照组大鼠的 HWL.
1. 3 统计学数据处理 实验所得的数据均以 x-± s形式表示,组间对比用独立样本 t 检验的方法进行统计处理.P < 0. 05,P < 0. 01,P < 0. 001表示统计结果具有显著差异性.
2 结果
2. 1 LHb 内微 量浓度为 0. 875、1. 75、3. 5 和7 nmol / μl的 CGRP 的结果见表 1 ~ 4.实验结果表明,LHb 内微量注射 0. 875 nmol/μl CGRP 组与对照组相比大鼠左爪热刺激 HWL 有差异( P <0. 05) ,对大鼠右爪热刺激 HWL 有显著差异( P < 0. 001) ,见表 1; 微量注射浓度为 1. 75、3. 5 和 7 nmol/μl CGRP与对照组相比引起大鼠左、右爪热刺激 HWL 有显著性差异( P <0. 001) ,见表2 ~4.LHb 内微量注射0. 875 nmol / μl CGRP 与对照组相比大鼠左爪机械刺激 HWL 有显著差异( P <0. 001) ,而对大鼠右爪机械刺激 HWL 无差异( P >0. 05) 见表 1; 微量注射浓度为 1. 75、3. 5 和 7 nmol/μl CGRP 组与对照组相比引起大鼠左、右爪机械刺激 HWL 有显著性差异( P <0. 001) ,见表 2 ~4.即 LHb 内微量注射 CGRP可以引起明显的镇痛作用.
2. 2 CGRP 对正常大鼠的镇痛作用具有剂量依赖性,且在 20 min 时镇痛效果最为明显,如图 1 所示.
3 讨论
目前应用于临床的镇痛药物多为吗啡、杜冷丁等阿片类药物,在让病人忘记疼痛的同时,也会产生耐药性以及成瘾性[14-16].因此,研究新型镇痛药物具有重要的生理学意义.而 CGRP 作为一种新型的神经肽,在体内分布广,功能多,并且可以避免阿片类药物的成瘾性等副作用,研究其在中枢水平的镇痛作用,在临床具有十分广阔的意义.
本实验采用对大鼠 LHb 分别微量注射 CGRP( 用生理盐水配置) 和生理盐水的方法,来探讨CGRP 对大鼠痛觉的调节作用.结果表明,注射CGRP 组的大鼠与注射生理盐水组的大鼠相比,HWL 明显增加,说明 CGRP 在大鼠的 LHb 起到了镇痛作用,并且这种镇痛效果在 20 min 左右最为明显,具有时间上的规律性.
此外,有学者研究 CGRP 在大鼠扣带束及周围皮质对伤害性刺激反应的作用,结果表明注射一定剂量的 CGRP 能显著降低大鼠对机械刺激的 HWL,使大鼠对热板和机械压力刺激产生痛敏反应,同样有研究表明,在脑内某些核团微量注射 CGRP 均能延长大鼠的 HWL 值,如中脑导水管周围灰质、侧脑室等[7,8,17].这是因为降钙素基因相关肽所在部位不同,与其不同受体结合导致的作用结果可能会不一样所致.在实验中还发现,对大鼠 LHb 微量注射4 个不同浓度 ( 0. 875、1. 75、3. 5 和 7 nmol / μl) 的CGRP 作用效果不同,大鼠的后爪缩爪反应潜伏期也有显著差异.通过观察图表,可以得出结论,随着注射 CGRP 浓度的逐渐增加,大鼠的 HWL 也逐渐增加,说明 CGRP 具有镇痛作用且具有剂量依赖性.
根据不同的药理学特征,可以将 CGRP 受体分为两类,即 CGRP1 受体和 CGRP2 受体.有研究表明,CGRP2 受体 可 被 CGRP 所 激 动[3-8],但 是 对CGRP8-37 的拮抗作用不明显; 而相反的 CGRP1 受体对 CGRP8-37 的阻断效应较为敏感,但是高剂量的 GGRP8-37 也可以成为受体的激动剂[17].同时,Bartho 等[18]也发现 CGRP 受体的阻断剂 CGRP8-37可以部分逆转由辣椒素所诱导的痛觉过敏及异常疼痛[19].但 CGRP 在 LHb 对大鼠的镇痛作用机制尚不十分清楚,有待于一步的探讨研究.
参考文献:
[1] 于龙川主编. 神经生物学[M]. 北京: 北京大学出版社,2012:141-147.
[2] Dobolyi A,Irwin S,Makara G,et al. Calcitonin gene-related pep-tide-containing pathways in the rat forebrain[J]. J Comp Neurol,2005,489( 1) : 92-199.
[3] Poyner DR. Pharmacology of receptors for calcitonin gene-relatedpeptide and amylin[J]. Trends Pharmacol Sci,1995,16: 424-428.
[4] 王福庄,丁爱石,陈 嘉,等. 降钙素基因相关肽增加大鼠脑血流量[J]. 生理科学,1989,9( 5) : 50-51.
[5] Smith FL,Welch SP,Dombrowski DS,et al. The role of endoge-nous opioids as mediators of the hypothermic effects of intrathecallyadministered calcium and calcitonin gene-relayed peptid in mice[J]. J Pharmacol Exp Ther ,1993,266: 1407-1415.
[6] Saurabh Guptal,Dipak Vasantrao Amrutkar,et al. Evidence forCGRP re-uptake in rat dura mater encephali[J]. Br J Pharmacol,2010,8( 161) : 1885-1898.
[7] 张继峰,唐朝枢. 脑室内注射降钙素基因相关肽对压力感受性反射的抑制[J]. 中国应用生理学杂志,1995,12( 3) : 280.
[8] 徐世莲. 炎症大鼠中脑导水管周围灰质注射降钙素基因相关肽对痛觉的影响[J]. 昆明医学院学报,2006,27 ( 2) : 23-27.
[9] Huang YH,Brodda-Jansen G,Lundeberg T,et al. Anti-nociceptiveeffects of calcitonin gene-related peptide in nucleus raphe magnusof rats: an effect attenuated by naloxone[J]. Brain Res,2000,873:54-59.
[10] Xu W,Lundeberg T,Li Y,et al. Antinociception effect of calcito-nin gene-related peptide in central nucleus of amygdale: activatingopioid receptors though amgdala-periaqueductal gray pathway[J]. Neurosciecne,2003,118: 1015-1022.
[11] 付立波,王学斌,刘凤莲. 腺苷对大鼠缰核神经元自发放电活动及 c-fos 蛋白表达的影响[J]. 中国免疫学杂志,2010,26( 2) : 141-145.
[12] 黄 民,王 绍,徐海燕. 侧脑室注射腺苷对大鼠缰核痛神经元自发放电活动的影响[J]. 中国老年学杂志,2011,31( 7) :1186-1187.
[13] 孙衍刚,于龙川. 甘丙肽参与痛觉调制的研究进展[J]. 中国疼痛医学杂志,2004,10( 4) : 108-110.
[14] 杨燕平,舒爱霞,付立波. 白酒对老年性大鼠的镇痛作用[J].黑龙江畜牧兽医( 科技版) ,2013,( 3) 138-139.
[15] 付立波. 侧脑室注射淫羊藿苷对正常大鼠痛觉调节的影响[J]. 中国老年学杂志,2012,32( 13) : 2775-2776.
[16] 王加真,张 军. Facilitating effects of CGRP or SP in cingulumbundle / surrounding cortex tissur in rats[J]. 中国神经科学杂志,2001,17( 4) : 304-308.
[17] van Rossum D,Hanisch UK,Quirion R. 1997. Neuroanatomicallocalization,pharmacological characterization and function ofCGRP,related peptides and their receptors[J] . Neurosci Biobe-hav Rev,1997,21: 649-678.
[18] Bartho L,Koczan G,Holzer P,et al. Antagonism of the motoreffects of CGRP and of capsaicin on the guinea pigileum by hu-man CGRP8-37[J]. Ann N Y Acad Sci,1992,657: 538-540.
[19] Verheggen R,Bumann K,Kaumann K,et al. BIBN4096BS is apotent competitive antagonist of the relaxant effects of α-CGRP onhuman temporal artery: comparison with CGRP( 8-37) [J]. Br JPharmacol,2002,136( 1) : q120-126.
