摘 要： 目的 观察蛴螬多肽提取物对免疫抑制小鼠的免疫功能的影响。方法 采取蛋白酶水解提取蛴螬多肽, 电泳确定相对分子质量大小, 然后每天给小鼠灌服不同剂量多肽连续20 d, 除对照组外其余小鼠在实验结束前连续3 d腹腔注射环磷酰胺, 试验结束小鼠称体质量、采血、无菌操作制备脾脏细胞, 体外培养添加脂多糖和刀豆蛋白A诱导细胞分化, 采用MTT和Griess法检测细胞增殖率和NO分泌量;分光光度法和流式技术检测血清溶血素及巨噬细胞吞噬功能, 迟发型超敏反应分析免疫原性。结果 酶解提取蛴螬多肽质量浓度为37.01 mg/ml, 提取率为31.63%, Mr在8 000～9 000。模型组小鼠脾脏肝脏胸腺指数显着低于对照组和蛴螬组, 小鼠脾脏和骨髓T、B淋巴细胞存活率及NO分泌量明显低于对照组和蛴螬组, 其中骨髓B淋巴细胞存活率显着高于T淋巴细胞, 但脾脏和骨髓T淋巴细胞NO分泌量高于B淋巴细胞;对照组和蛴螬多肽组小鼠溶血素吸光度值显着高于模型组, 随着蛴螬多肽剂量增加溶血素含量逐渐提高, 但不存在剂量效应关系;蛴螬组小鼠血液白细胞数均高于模型组, 随着剂量增加白细胞数提高;中高剂量蛴螬多肽组小鼠耳肿胀度高于模型组, 随着蛴螬剂量增加耳肿胀度显着增加, 存在剂量效应关系;蛴螬组小鼠腹腔骨髓脾脏巨噬吸光度值高于模型组, 随着蛴螬多肽剂量增加吸光度值提高, 存在剂量效应关系;流式细胞技术检测结果蛴螬组巨噬细胞吞噬鸡红细胞荧光强度强于模型组, 巨噬细胞吞噬鸡红细胞阳性细胞数不明显高于模型组, 结果提示巨噬细胞吞噬能力强。结论 蛴螬多肽具有明显增强免疫抑制小鼠免疫功能的作用。
关键词： 蛴螬多肽; 小鼠; 免疫功能;
Abstract： This study was performed to investigate the effects of polypeptide extracts from grub on immune function of immunosuppressive mice. The grub polypeptides (GP) were extracted by protease method, and the size of the molecule was determined by electrophoresis. Then the mice were given orally different doses of grub peptides for20 days. All mice except the mice in control group were intraperitoneally injected with cyclophosphamide (CTX) for 3 days before the end of the experiment. The mice were prepared by weighing, collecting blood and aseptic operation for spleen cells. The cell differentiation was induced by lipopolysaccharide (LPS) and concanavalin A (ConA) , and cell proliferation and NO level were detected by MTT and Griess method. The serum haemolysin and macrophage phagocytosis were evaluated by spectrophotometry and flow cytometry, while the immunogenicity was analyzed by delayed hypersensitivity. Data showed that the concentration of polypeptide extracted by enzymolysis was 31.63% and the extraction rate was 37.01 mg/ml, with molecular weight of8 to 9 KDa. The spleen and liver thymus indexes of mice in model group were significantly lower than those of the control and the grub groups. The survival rate of splenetic and myeloid T and B lymphocytes and the secretion of NO in model mice were significantly lower than those of the control and the grub groups. The survival rate of B lymphocyte from bone marrow was significantly higher than that of T lymphocyte, but the secretion of NO in the spleen and bone marrow T lymphocyte was higher than that of B lymphocyte. The absorbance of haemolysin in control group and grub polypeptide group were significantly higher than that in model group. With the increasing of grub polypeptide dose, the content of hemolysin increased gradually, but there was no dose effect relationship. The number of white blood cells in grub groups was higher than that in model group. The ear swelling of the mice in medium and high dose grub polypeptide groups were higher than that of model group. With the increasing of grub dose, the ear swelling thickness increased significantly, and there was a dose effect relationship. The absorbance values of the macrophages from abdominal cavity and bone marrow as well as spleen of grub group were higher than those of model group, and there was a dose effect relationship. The fluorescence intensity of macrophage phagocytosis in grub group was stronger than that of model group, and the number of positive cells of macrophages phagocyting red cell was not significantly higher than that of model group, which suggested that the macrophage phagocytosis was strong. Taken together, polypeptides from grub can significantly enhance immune function in immunosuppressed mice.
Keyword： Grub polypeptide; Mice; Immune function;
蛴螬为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子及同属近缘昆虫的干燥幼虫, 在江苏、安徽、山东和东北等地均有分布[1], 神农本草经记载其具有破瘀、止痛和解毒的作用。文献报道, 蛴螬主要含有脂肪酸类、蛋白质、糖类、生物碱和甾体化合物等[2,3]。金哲等[4]发现蛴螬联用羟基喜树碱对人MGC-803胃癌细胞株有显着性抗增殖作用, 陈梅等[5]发现蛴螬提取物能抑制家兔脉络膜新生血管中的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子表达, 抑制脉络膜新生血管的形成。
多肽是20种氨基酸以不同的的组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性或环形结构的具有不同生物活性肽类的总称[6], 由于多肽结构样式繁多, 其在人体生理和代谢上表现出多种药理活性, 主要有提高免疫力、降血糖和抗氧化等功能。严铭铭等[7]分离得到了单一鹿茸多肽CNT14, 其能够明显促进小鼠海马HT22细胞增殖。
本研究拟从蛴螬中提取蛴螬多肽, 通过体内试验分析其免疫调节作用, 为蛴螬的开发应用提供试验依据。
1、 材料与方法
1.1 、实验材料
环磷酰胺 (CTX) 购于江苏恒瑞医药股份有限公司, DMEM高糖培养基和胎牛血清 (FBS) 均购自美国Gibco公司, RPMI1640培养基购自美国HyClone公司, 刀豆蛋白 (ConA) 和脂多糖 (LPS) 购自美国Sigma公司, 噻唑蓝 (MTT) 购自美国AMRESCO公司, 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 (CFSE) 购自北京化工厂, 蛴螬多肽 (GP) 由本实验室制备。细胞培养板和酶标板购自美国Corning公司, 二氧化碳培养箱为日本SANYO产品, XSZ-D2倒置生物显微镜为重庆光学仪器厂产品, 粉碎机 (小型) 购于日本日立公司。6～8周龄健康昆明小鼠, 体质量20～22 g, 购于中国军事医学科学院实验动物中心【SCXK- (京) 2016-0002】。
1.2、 蛴螬多肽的提取纯化及鉴定
1.2.1 、提取
取5 g蛴螬粉于含100 ml蒸馏水的烧杯中并调pH至8.0, 向其加入木瓜蛋白酶搅拌, 置于55℃水浴锅水浴2.5 h, 然后置于100℃沸水10 min终止酶解反应, 10 000 r/min离心15 min, 收集上清为蛴螬多肽粗提取物;粗提取物与10%三氯乙酸1.25 ml摇匀, 静置10 min, 4 000 r/min离心15 min, 取3 ml上清液加入2 ml双缩脲试剂混匀, 静置10 min后2 000 r/min离心10 min, 取上清于540 nm处测吸光度值, 同时制作谷胱甘肽标准曲线, 计算蛴螬多肽质量浓度及提取率。
1.2.2、 纯化
采用Mr 10 000膜超滤粗提物得>Mr10 000和<Mr 10 000多肽, 然后用10 ml玻璃分离柱, 0.02 mol/L的Tiris-HCl作为缓冲液, 0.5 mol/L的NaCl做梯度洗脱, 洗脱流速1 ml/min, 上样质量浓度25 mg/ml的上样量1～2 ml进行离子层析, 按洗脱峰收集分离纯化<Mr 10 000的蛴螬多肽, 备用。
1.2.3 、鉴定
采用Tricine-SDS-PAGE法鉴定蛴螬多肽相对分子质量, 首先按4∶1取蛴螬多肽和5×loading Buffer混合, 沸水浴10 min, 冷至室温备用;然后按照凝胶配方制胶;其次灌胶:取制胶架、1.5 mm制胶板、制胶夹和电泳槽一套, 组装并检查是否漏胶, 用加样枪缓缓注胶于装置内, 加样后用去离子水压平界面, 静置等待分层, 同理加入浓缩胶, 插入10孔梳子, 准备电泳;最后点样:装备好电泳设备后槽中加入电泳液, 依次加点样蛋白Marker 5?l和样品30?l。
1.3 、动物分组与给药处理
取50只健康昆明小鼠随机分对照组、模型组 (环磷酰胺组) 、蛴螬多肽组;蛴螬组小鼠每天1次灌服不同剂量蛴螬多肽 (50、100、200 mg/kg) , 对照组和模型组灌服等量生理盐水, 连续灌服20 d, 实验结束前3 d, 除对照组外其余小鼠每天腹腔注射环磷酰胺 (CY) 50 mg/kg, 连续3 d。
1.4 、小鼠白细胞数与脏器指数的测定
实验结束小鼠称体质量, 取全血于抗凝管中, 采用全血细胞分析仪检测白细胞数;颈椎脱臼处死小鼠, 摘取脾脏、肝脏、肾脏, 生理盐水清洗, 滤纸吸干后称质量, 按照公式计算脏器指数=脏器质量 (mg) /体质量 (g) 。
1.5、 小鼠迟发型变态反应 (DTH) 检测
末次给药后小鼠腹部剃毛, 均匀涂抹50?l二甲苯致敏, 4 d后在小鼠右耳均匀涂抹20?l二甲苯, 24 h后将小鼠颈椎脱臼处死, 用直径为8 mm打孔器在左右耳相同位置取下圆耳片称质量, 记录致敏前后质量之差即为其耳胀程度。
1.6、 小鼠淋巴细胞和巨噬细胞制备
处死小鼠无菌操作取脾于200目细胞筛研碎, 收集细胞悬液, 3 000 r/min离心4 min, 弃上清PBS悬浮细胞, 加红细胞裂解液1～2 min, 3 000 r/min离心4 min, 弃上清反复洗, 培养基重悬细胞, 加入细胞培养皿37℃5%CO2培养箱培养2～4 h, 收集未贴壁悬浮细胞, 3 000 r/min离心4 min, 弃上清加完全培养基重悬细胞, 计数调整细胞数至1×106/ml;同样方法收集贴壁细胞, 制备脾脏巨噬细胞;无菌操作取胫骨和股骨, 收集骨髓细胞于细胞培养皿, 同理脾细胞制备相同, 制备骨髓淋巴细胞和巨噬细胞备用 (运晨霞等) [8]。
1.7 、小鼠淋巴细胞增殖检测
取100?l脾细胞 (或骨髓细胞) 和100?l完全培养基加入96孔细胞板, T淋巴细胞组每孔加5?l 100?g/ml ConA, B淋巴细胞组每孔加2?l 1 mg/ml LPS, 置37℃5%CO2培养箱培养24 h, 然后每孔加入8?l 5 mg/ml MTT继续培养4 h, 吸弃上清每孔加150?l DMSO, 振荡10 min酶标仪570 nm测OD值, 计算细胞增殖率%=处理组吸光度值/对照组吸光度值×100%
1.8 、小鼠淋巴细胞分泌NO检测
吸取细胞上清100?l至酶标板中, 每孔加入等量Griess试剂, 室温反应10 min, 置于490 nm测吸光值, 根据NaNO2标准曲线, 计算细胞分泌NO量。
1.9 、染色法检测巨噬细胞吞噬功能
取100?l巨噬细胞悬液加入96孔细胞培养板, 置37℃5%CO2培养箱培养24 h, 弃上清, 每孔各加0.075%的中性红100?l, 继续培养3 h, 弃去中性红, 用PBS洗2次, 加细胞裂解剂 (醋酸∶无水乙醇=1∶1 V/V) , 酶标仪540 nm测吸光度值。
1.1 0 、流式细胞技术检测巨噬细胞的吞噬能力
1.1 0. 1、 CFSE标记鸡红细胞[9]
取鸡静脉采血, 制备新鲜鸡红细胞 (cRBC) , 加入PBS稀释, 1 600 r/min离心5 min, 弃上清, PBS重复洗2次, 用RPMI1640培养液将鸡红细胞数调为4×107/ml, 加入10 mmol/L的CFSE使其终浓度为5?mol/L, 37℃培养箱恒温孵育15 min, 取出加培养液终止反应, 1 600 r/min离心5 min, 弃上清, 培养液洗2次, 悬浮细胞计数, 将CFSE-cRBC细胞数调为2×106/ml, 以备用。
1.1 0. 2、 CFSE标记鸡红细胞与巨噬细胞共孵育[10]
将收集的巨噬细胞加入24孔细胞培养板, 置于37℃5%CO2培养箱内培养2～4 h, 取出弃上清加无菌PBS冲洗2次, 向细胞培养板各孔加2×106/ml CFSE-cRBC细胞液1 ml, 然后将其置于37℃5%CO2培养箱内共同孵育2～4 h。
1.1 0. 3 、流式细胞仪检测巨噬细胞的吞噬能力[11]
收集共同孵育的巨噬细胞和鸡红细胞于离心管, 1 600 r/min离心5 min, 弃上清, 加入缓冲液重悬细胞并将细胞数调为4×106/ml, 分别取各组100?l细胞悬液于流式管, 上流式细胞仪检测。
1.1 1、 血清溶血素含量测定
结束前7 d小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.2 ml, 末次给药24 h后, 采血制备血清, 生理盐水100倍稀释血清, 取稀释血清1 ml与5%鸡红细胞悬液0.5 ml以及10%豚鼠补体1 ml混合, 37℃温育30 min, 0℃终止反应, 离心取上清, 置于紫外分光光度计540 nm测OD值。
1.1 2、 统计学分析
数据以平均数±标准差表示, 采用t检验分析, P<0.05认为差异有统计学意义。
2、 结果
2.1 、蛴螬多肽的提取纯化与鉴定
采用酶解法制备蛴螬多肽, 其中料液比1∶20、加酶量和酶解的时间分别为6 000 U和2.5 h, 利用谷胱甘肽标准曲线测得蛴螬多肽粗提取物质量浓度为37.01 mg/ml, 提取率为31.63%;通过超滤和离子层析得2个组分蛴螬多肽 (图1) , 收集高峰洗脱出来多肽, 采用TricineSDS-PAGE鉴定蛴螬多肽分子大小, 结果观察电泳图, 根据Marker蛋白相对分子质量对比, 提取的蛴螬多肽分子为相对分子质量8 000～9 000的小肽 (图2) 。
2.2、蛴螬多肽对小鼠脏器指数的影响
根据小鼠体质量和脏器质量比较, 结果小鼠脏器指数见表1。由表1知, 模型组小鼠脾脏肝脏胸腺指数显着低于对照组, 而蛴螬组小鼠脾脏肝脏胸腺指数提高, 且显着高于模型组, 随着蛴螬多肽剂量增加, 其中脾脏指数逐渐提高, 存在着剂量效应关系。
图1 蛴螬多肽提取物离子层析纯化图
Fig 1 Ion chromatography purification of polypeptides extracts from the grub
图2 Tricine-SDS-PAGE分析蛴螬多肽分子大小
Fig 2 Tricine-SDS-PAGE analysis for the molecule size of grub polypeptides
2.3 、蛴螬多肽对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖和分泌NO的影响
采用MTT法对免疫抑制小鼠不同组织淋巴细胞增殖分析, 结果模型组小鼠T、B淋巴细胞存活率明显低于对照组, 蛴螬组脾脏和骨髓T、B淋巴细胞存活率高于模型组, 其中脾脏B淋巴细胞存活率显着增加, 而且高于脾脏T淋巴细胞 (图3a) ;蛴螬组骨髓T淋巴细胞存活率为81.48%±5.23%, B淋巴细胞存活率为95.27%±5.56%, 骨髓B淋巴细胞存活率显着高于T淋巴细胞 (图3b) 。
表1 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠脏器指数的影响
a) P<0.05, b) P<0.01, vs control group;c) P<0.01, vs model group.
采用Griess法分析淋巴细胞分泌NO情况, 结果模型组小鼠脾脏和骨髓T、B淋巴细胞NO分泌量明显低于对照组, 蛴螬组T、B淋巴细胞NO分泌量较模型组明显增加, 随蛴螬多肽剂量增加淋巴细胞分泌NO量逐渐提高, 存在剂量依赖关系 (图4) , 其中脾脏T淋巴细胞NO量达到 (1.33±0.11) mmol/L, 而B淋巴细胞高达 (1.26±0.08) mmol/L (图4a) , 骨髓T淋巴细胞NO浓度达到 (1.55±0.05) mmol/L, B淋巴细胞高达 (1.34±0.13) mmol/L (图4b) , 脾脏和骨髓T淋巴细胞分泌NO量高于B淋巴细胞。
图3 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖的影响
Fig 3 Effects of grub polypeptides on the proliferation of lymphocytes in immunosuppressive mice
a) Splen;b) bone marrow.**P<0.01, vs control group;△P<0.05, vs model group.
图4 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠淋巴细胞NO分泌的影响
Fig 4 Effects of grub polypeptides on NO secretion from lymphocytes of immunosuppressive mice
a) Splen;b) bone marrow.**P<0.01, vs control group;△P<0.05, △△P<0.01, vs model group.
2.4、 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
采用分光光度法分析巨噬细胞吞噬功能, 结果模型组腹腔脾脏骨髓巨噬细胞吸光度值显着低于对照组, 蛴螬组小鼠腹腔骨髓脾脏巨噬吸光度值高于模型组, 随着蛴螬多肽剂量增加吸光度值提高, 存在剂量效应关系 (图5) ;3种组织巨噬细胞之间比较, 腹腔和脾脏巨噬细胞吸光度值高于骨髓巨噬细胞。采用流式细胞技术分析腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力, 结果蛴螬组巨噬细胞吞噬鸡红细胞荧光强度强于模型组, 巨噬细胞吞噬鸡红细胞阳性细胞数不明显高于模型组, 结果提示巨噬细胞吞噬能力增强了 (图6) 。
图5 分光光度法分析蛴螬多肽对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
Fig 5 Effects of grub polypeptides on the phagocytosis of macrophages from immunosuppressive mice detected by spectrophotometry
**P<0.01, vs control group;△P<0.05, △△P<0.01, vs model group.
2.5、 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠白细胞数和溶血素的影响
采用分光光法检测小鼠血清溶血素含量, 结果对照组和蛴螬多肽组小鼠溶血吸光度值显着高于模型组组, 随着蛴螬多肽剂量增加小鼠血清溶血素含量逐渐提高, 但不存在剂量效应关系。采用血细胞分析仪检测小鼠血液中白细胞数, 结果模型组小鼠血液白细胞数低于对照组, 蛴螬组小鼠血液白细胞总数均高于模型组, 随着剂量增加白细胞数提高, 且高剂量组呈现极显着性差异, 结果提示蛴螬多肽能增加小鼠血液中白细胞的数量 (表2) 。
表2 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠白细胞与溶血素的影响
a) P<0.05, b) P<0.01, vs control group;c) P<0.05, d) P<0.01, vs model group.
图6 流式细胞技术分析蛴螬多肽对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
Fig 6 Effects of grub polypeptides on the phagocytosis function of macrophages from immunosuppressive mice detected by flow cytometry technology
*P<0.05, **P<0.01, vs model group.
2.6、 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠DTH反应强度的影响
DTH是检测细胞免疫功能的常用方法, 通过称重小鼠左右耳片质量, 计算耳肿胀度。结果模型组小鼠耳肿胀度显着低于对照组, 中高剂量蛴螬多肽组小鼠耳肿胀度高于模型组, 随着蛴螬剂量增加耳肿胀度显着增加, 存在着剂量效应关系 (图7) 。
图7 蛴螬多肽对免疫抑制小鼠DTH反应强度的影响
Fig 7 Effects of grub polypeptide on DTH response intensity in immunosuppressed mice
*P<0.05, vs control group;△P<0.05, △△P<0.01, vs model group.
3 、讨论
活性肽是由20种天然氨基酸以不同的组成和排列方式构成的环形或线性肽类的总称, 源于蛋白质的功能性化合物, 而活性肽在母体蛋白中通常没有活性[12], 因此生物活性肽的制备引起越来越多的学者关注和研究。目前制备生物活性肽的最常用方法是酶水解法, 经酶解植物或动物蛋白获得多肽具有良好的理化性质和功能性质[13,14]。酶解的条件对活性多肽的制备都有至关重要, 蛋白酶在最适的环境下达到最大酶解效率。本实验酶解的条件料液比1∶20、酶解时间2.5 h和加酶量6 000 U, 获得螬多肽浓度为37.01 mg/ml, 提取率为31.63%, Mr为8 000～9 000。
环磷酰胺 (CY) 作为癌症化学治疗药物, 是一种作用强、疗效好的常用免疫抑制剂广泛应用于临床建立小鼠免疫抑制模型, 用来观察免疫促进药物对免疫功能的影响, 但因其非特异性的毒性作用, 除杀伤癌细胞外对正常细胞具有毒性作用[15,16,17]。本研究结果表明, 与正常对照组比较, CY模型组小鼠脾脏淋巴细胞增殖、NO分泌和巨噬细胞吞噬功能明显被抑制, 血清溶血素含量显着降低, 结果表明环磷酰胺具有明显的免疫毒性。
白细胞是机体防御系统的重要组成部分, 白细胞数降低, 提示机体抵御细菌入侵的能力减弱, 易受感染。本研究蛴螬多肽能使免疫低下小鼠的外周血白细胞数升高至正常水平, 表明蛴螬多肽可以改善机体的细胞免疫状态。单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一, 蛴螬多肽提高免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力, 对免疫抑制小鼠吞噬功能有促进作用。
免疫器官的发育决定了免疫功能的强弱, 机体免疫功能情况可由淋巴细胞的增殖能力间接反映, 如淋巴细胞的活化以及分化为免疫活性细胞, 进而增强机体的免疫应答能力[18]。本试验淋巴细胞增殖转化结果显示高剂量蛴螬多肽能够促进免疫抑制小鼠脾脏T、B淋巴细胞增殖, 低剂量促进作用不明显。DTH体现了机体的细胞免疫状态, 是T细胞介导的细胞免疫应答[19]。本研究结果显示, 蛴螬多肽可以增强小鼠DTH强度, 且存在计量效应关系, 随蛴螬多肽的浓度增加而增强。说明蛴螬多肽可以改善免疫抑制小鼠的细胞免疫功能。
NO是一种细胞间信息传递的双向调节因子, 能缓解血管平滑肌紧张度、影响淋巴细胞增殖、免疫应答等。研究报道, 细菌脂多糖能使免疫细胞NO分泌量升高, 增强机体的免疫功能[20]。研究结果表明蛴螬多肽促进免疫抑制小鼠脾脏淋巴细胞分泌NO, 提示其参与免疫调节。
异源动物红细胞免疫动物后, B淋巴细胞可产生抗RBC抗体, 即溶血素。这种抗体在体外与免疫源性RBC温育后, 在补体参与下可产生溶血反应, 检测反应体系溶血后光密度吸收值可以反映溶血素水平, B淋巴细胞产生特异性抗体的能力, 以此评价机体的体液免疫功能[21,22]。试验结果蛴螬组小鼠外周血溶血素含量明显高于模型组, 低剂量蛴螬多肽可极显着提高免疫抑制小鼠外周血溶血素含量, 拮抗CY所致的体液免疫抑制, 表明蛴螬多肽能够提高小鼠体液免疫能力。
综上所述, 蛴螬多肽能对免疫抑制药环磷酰胺引起的免疫抑制小鼠特异性及非特异性免疫功能均有促进作用, 试验结果提示其可有望成为一种新的安全高效的免疫调节剂开发, 但其免疫调节作用机制还有待进一步研究。
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