第3章 地沟油快速检测方法的研究
3.1 前言
地沟油在被收集、提炼、储运过程中会发生了一系列的劣变反应，由第2章中理化指标的检测结果可知，地沟油过氧化值、酸价的检测值与正常食用油的检测值差异较大，如粗制潲水油的酸价高达7.72mgKOH/g,煎炸老油7号也高达5.76mgKOH/g,加工过的地沟油2号酸价也达到了3.01mgKOH/g;久置自榨茶油的过氧化值高达2.52g/100g,加工过的地沟油2号也高达0.65g/100g,比正常食用油都高出很多。
本章拟从过氧化值、酸价入手进行研究，以建立地沟油快速检测方法。
3.2 材料与方法
3.2.1 材料与设备
3.2.1.1 主要试剂与材料
溴甲酚绿溶液：称取0.2g溴甲酚绿溶于100mL无水乙醇中，并将pH调节在7±0.5范围内。
0.2%CMC-Na:称取0.2gCMC-Na溶于100mL蒸馏水中，然后在沸水浴上加热搅拌，到浑浊，再到澄清，然后冷却到室温，拿到离心机里面，离心，取上清液。
0.2%次甲基蓝溶液：称取0.2g次甲基蓝溶于100mL无水乙醇中，转移至试剂瓶中备用。
0.2%碱性藏花红溶液：称取0.2g碱性藏花红溶于100mL蒸馏水中，转移至试剂瓶中备用。
硅胶G60,亚甲基蓝，碱性藏花红，苯，液体石蜡，乙醇，葡萄糖，氢氧化钠，均为分析纯。
第2章中已经测出酸价和过氧化值的34种油样。
3.2.1.2 仪器与设备
玻璃板5*1cm,干燥器，移液枪，试剂瓶，具塞比色管（10mL），样品瓶（2mL）。
3.2.2 试验方法
3.2.2.1 酸价快速检测方法的初步验证、优化
参照王乐[28]的餐饮废油脂快速检测试纸方法进行验证、优化。
（1）显色液
称取0.2g溴甲酚绿溶于100mL无水乙醇中，密封备用。
（2）薄层色谱板的制作
根据文献[28]制备硅胶薄层色谱板。
用NaOH、HCl稀溶液调整显色液pH在7±0.5,将制备好的薄层色谱浸入显色液中，吸收完全后拿出晾干，放干燥器中备用。
（3）标准比色板的制作
根据第2章中酸价测定值，选择有酸价梯度的八个油样（八个油样对应酸价分别为0.12、0.56、2.06、3.01、3.95、4.89、5.89、7.72mgKOH/g）作为标准油样进行显色反应。分别取0.1mL标准油样滴加到做好的显色硅胶板上，根据其显色差异，做出与酸价对应的标准比色板。
（4）油样的检测
对已知酸价的34种油样进行快速检测，15s内观察显色板颜色变化，与酸价的标准比色板比较，并判断此方法的显色结果是否与第2章中用国标检测的酸价结果一致。
（5）酸价快速检测方法的优化
从显色载体的选择、显色剂的选择、适宜显色时间、温度以及pH对酸价快速检测方法进行优化。
3.2.2.2 过氧化值的快速检测试剂盒的制作
（1）载体的选择
选择10mL的具塞比色管，洗净晾干，备用。
选择2mL的样品瓶，洗净晾干，备用。
根据显色明显度以及成本来选择合适的载体。
（2）显色剂的确定
以蓝瓶子实验为依据，通过显色效果来确定显色剂中各试剂的适宜添加量。
以红瓶子实验为依据，通过显色效果来确定显色剂中各试剂的适宜添加量。
根据显色明显度以及成本来选择合适的显色剂。
（3）显色管的制作
取一定量的显色剂溶液加入到10mL比色管中并加入一定量的液体石蜡（封闭剂），盖上塞子，静置待比色管中溶液完全褪色后。
取一定量的显色剂溶液加入到2mL样品瓶中并加入一定量的液体石蜡（封闭剂），塞上塞子，静置待样品瓶中溶液完全褪色后。
经过反复试验，以显色效果为依据，确定进行检测时的显色剂的添加量、封闭剂的添加量以及油样的添加量。
（4）适宜显色时间的确定
分别比较两种不同显色剂的显色时间效果，根据显色效果确定适宜显色时间。
（5）标准比色管的制作
根据第2章中过氧化值测定值，将过氧化值分别为0.02、0.11、0.23、0.32、0.44、0.65、1.47、2.52g/100g的油样作为标准油样分别取规定量，做出与过氧化值对应的标准比色管。
（6）样品的检测
选择16种已知过氧化值的油样进行显色反应，在适宜显色时间内观察比色管中颜色变化，与过氧化值对应的标准比色管比较，并判断此方法的显色结果是否与第2章中用国标检测的过氧化值结果一致。
3.3 结果与讨论
3.3.1 酸价的快速检测试纸验证结果
（1）标准比色板的制作
制作的酸价标准比色板的效果图见图3.1.
由图3.1可以看出，随着油品酸价的升高，深蓝色硅胶板颜色的变化次序为深绿色、浅绿色、黄绿色、黄色；显色的范围也由圆圈到实心圆依次递变。当酸价达到3.95mgKOH/g时，可以观察到明显的黄绿色；当酸价大于4.89mgKOH/g时，硅胶板显黄色，显色范围为实心圆，无大的变化。由标准比色板可以初步判断，当硅胶板的深蓝色没有变时，表明油样酸价很低；当硅胶板颜色为深绿至浅绿色时，表明油样开始变质；当硅胶板颜色为黄绿色时，表明油样酸价刚好超标；当硅胶板颜色为黄色时，表明油样酸价很高，已经严重变质，可怀疑其地沟油。
（2）34种未知样品的检测结果
34种未知样品的显色结果如图3.2所示。由图3.2的检测结果可知，不同酸价的油样呈现出不同的颜色，酸价越高的油样在硅胶板上的显色越黄；酸价越低的油样使硅胶板上的颜色变化越小；显色结果与标准比色卡进行比较后，判断出序号为1、6、9、18、22、24、32号的油样有可能为地沟油，这与表3.1中用GB/T5009.37-2003方法检测的酸价判断结果一致。由表3.1可知序号为22、23、28号的油样酸价分别3.13mgKOH/g、3.02mgKOH/g、3.01mgKOH/g,已经超过了国家规定的最高限度，但使用酸价快速检测方法检测的结果却是符合国家标准的。
故此方法存在两点局限性：第一，只有当地沟油或掺假食用油酸价大于3.95mgKOH/g时，才可被鉴定出来；第二，当酸价差距不大的油样进行显色对比时颜色差异不明显，容易造成误判。
本研究对显色载体的选择、显色剂的选择、适宜显色时间、温度以及pH进行了优化试验，想通过优化来解决此方法的局限性，但是效果不明显。
3.3.2 过氧化值快速测定结果
3.3.2.1 显色剂的配制
（1）次甲基蓝显色剂溶液
经过反复试验，对比显色效果，确定亚甲基蓝显色剂的配制方法为：
称取3.0g葡萄糖和0.3g氢氧化钠于小烧杯中，加100mL去蒸馏水溶解，待完全溶解之后加入1mL的0.2%次甲基蓝显色剂，搅拌混匀，密封备用。
（2）碱性藏花红显色剂溶液
经过反复试验，对比显色效果，确定碱性藏花红显色剂配制方法为：
称取3.0g葡萄糖和1g氢氧化钠于小烧杯中，加100mL去蒸馏水溶解，待完全溶解之后加入1mL的0.2%碱性藏花红显色剂，搅拌混匀，密封备用。
3.3.2.2 显色管的制作
（1）以10mL比色管为载体的显色管的制作
经过反复试验，确定以10mL比色管为载体的显色管的制作如下：取显色剂溶液5mL加入到10mL比色管中并加入2mL液体石蜡（封闭剂，用以隔绝空气），盖上塞子，静置1h,待比色管中溶液完全褪色后，用移液枪加入待测油样1mL,再静置数分钟，观察油样上下液面颜色变化。
（2）以2mL样品瓶为载体的显色管的制作
经过反复试验，确定以2mL样品瓶为载体的显色管的制作如下：取显色剂溶液1mL加入到2mL样品瓶中并加入0.5mL液体石蜡，塞上塞子，静置30min,待样品瓶中溶液完全褪色后，用针管注射待测油样0.5mL,再静置数分钟，观察油样上下液面颜色变化。
3.3.2.3 两种显色剂的显色效果比较（以10mL比色管为载体）
（1）以亚甲基蓝做显色剂，按照过氧化值快速检测方法进行试验，7种煎炸老油的显色结果如图3.3所示。
（2）以碱性藏花红为显色剂，按照过氧化值快速检测方法进行试验，7种煎炸老油的显色结果如图3.4所示。
比较图3.3、3.4可以发现，当以亚甲基蓝为指示剂时，过氧化物的显色与油样自身的颜色叠加后会有变绿色现象；当以碱性藏花红为指示剂时，过氧化物的显色与油样自身的颜色叠加后会有变棕色现象，以亚甲基蓝做显色剂比藏花红的显色效果更明显，因此选择亚甲基蓝作为显色剂进行试剂盒的制作。
3.3.2.4 过氧化值标准比色管的制作
以亚甲基蓝为显色剂，加入不同过氧化值的油样制作出过氧化值标准比色管如图3.5所示。
由图3.5可观察到显色分为上中下三层，上层是石蜡与显色剂的混合层，与油样的显色效果比较明显，随着油样过氧化值的升高，上层颜色由淡粉色逐渐变为深粉色、浅紫色、深蓝色；中层是油样层，显示油样本身的颜色；下层是油样与显色剂的交界面，也能从颜色的变化上反应出油脂的过氧化值的大小，但区分度不明显；所以观察显色效果主要是看上层。当过氧化值大于1.47g/100g时，比色管上层显深蓝色，显色分层明显。对比标准比色管可以判断，当显色管上层颜色为淡粉色时，表明油样过氧化值很低；当显色管上层颜色为深粉色至浅紫色时，表明油样已有变质的趋势；当显色管上层颜色为深蓝色时，表明油样过氧化值很高，已经严重变质，可怀疑其为地沟油。
3.3.2.5 油样的检测结果
8种盲样的显色结果如图3.6所示。由图3.6可以看出，不同过氧化值的油样所显现出的颜色深浅不同，且随着过氧化值的增加蓝色变深，不同油样显现出的颜色范围也有不同。地沟油由于自身品质差，在比色管中显现较深的蓝色；且随着过氧化值的增高，显现的颜色周围有浑浊现象出现；与标准比色管进行比较，判断出序号为5、6、7、8号的油样有可能为地沟油，这与表3.2中用GB/T5009.37-2003方法测定出的过氧化值判断结果一致，但由于显色范围不够清晰，可能造成误判，所以还需进一步优化。
当以10mL的比色管为载体时，加入的显色剂的量和油样的量都比较大，并且显色管上部分还有相当长的空余部分，空气的存在对显色有影响，而且10mL的比色管体积大，不方便携带。为了节约成本、减少空气的影响、方便携带，接下来进行优化试验。
3.3.2.6 载体优化结果
以2mL的样品瓶为显色载体进行优化试验。
（1）样品瓶的预处理
用移液枪移取1mL亚甲基蓝显色剂溶液加入到样品瓶中，并加入0.5mL液体石蜡，塞上塞子，静置至无色（如图3.7所示），装入到试剂盒中备用。样品瓶不能被剧烈摇动，使用时石蜡层（上层）有变粉红是正常现象；样品瓶中溶液不能接触空气，进样时需使用注射器从上部塞子白色部分将油样注射进溶液中。
选用2mL的样品瓶做载体，节省了试剂的用量，防止了显色剂与空气的接触而造成的影响，但是由图3.8可知，显色效果不太明显，不能很好的区分各类油样，所以还需继续优化。
3.3.2.7 试剂盒的优化与检测
（1）两种显色剂适宜显色时间的确定
从进样开始观察、记录颜色变化，在0~40min以内的显色过程中发现10min与30min为颜色变化的两个分界点，所以后面的试验取这两个时间点观察显色情况。
①按照过氧化值快速检测方法进行试验，得到碱性藏花红显色剂不同显色时间的效果如图3.9所示。
由图3.9可知，以碱性藏花红为显色剂时，30min的显色效果图中显色区域的红色更加明显，说明此时油脂中的过氧化物与显色剂基本反应完成，而10min的时候还没能反应完成。30min的显色效果能更好的反映过氧化值的大小，所以选择碱性藏花红显色剂的适宜显色时间为30min.
②按照过氧化值快速检测方法进行试验，得到亚甲基蓝显色剂不同显色时间的效果如图3.10所示。
由图3.10可知，以亚甲基蓝为显色剂时，10min的显色效果图中显色区域的蓝色更加明显，说明此时油脂中的过氧化物基本与显色剂反应完成；显色30min时，显色区域的部分颜色已经褪去，降低了试验的准确性。所以选择亚甲基蓝显色剂的适宜显色时间为10min.
（2）两种显色剂显在适宜显色时间的显色效果对比
按照过氧化值快速检测方法进行试验，将碱性藏花红显色30min的效果与亚甲基蓝显色10min的效果对比，如图3.11所示。
通过对比图3.11中a）、b）的显色时间与显色效果可知，用亚甲基蓝指示剂来指示过氧化物时显色时间短，并且显色效果更明显，故选择亚甲基蓝为试剂盒的显色剂。
（3）盲样的代入检测结果
按照过氧化值快速检测的方法进行试验，将不同油样加入到样品瓶中后显色情况如图3.12所示。
由图3.12可再次证明在过氧化值快速检测方法中，亚甲基蓝指示剂优于碱性藏花红指示剂，优化后的试剂盒检测不同油样的显色效果比较明显，区分度也比较高。并且根据显色情况做出的判断与表3.3中用GB/T5009.37-2003方法检测的过氧化值结果一致，此试剂盒可简单快速地判断出正常油与地沟油，具有简单方便、快速、经济等特点；相比酸价快速检测方法而言，具有灵敏、准确、颜色稳定等特点；适用于现场及试验室对地沟油、掺伪食用油的快速鉴定。
3.4 本章小结
本章从油的酸价、过氧化值两方面入手进行了地沟油快速检测方法的研究。一方面，参照文献制作了以玻璃板为载体的微型薄层色谱。利用制作好的硅胶板可在15s内测定食用油的酸价范围，检测时只需取0.1mL油样滴在硅胶板上，快速显色后与标准比色板对比即可得出酸价范围，从而初步判断油质的好坏，但是只有当地沟油或问题油样的酸价大于3.95mgKOH/g时，才可被鉴定出来，并且酸价差距不大的油样颜色对比不明显，容易造成误判。本研究试图从显色条件、显色剂、粘合剂、显色载体上进行优化，以此来解决此方法的局限性，但是没有成功。
另一方面，根据氧化还原的原理试制试剂盒，通过显色剂的选择、显色时间的确定等条件试验，确定过氧化值试剂盒以2mL的样品瓶做载体、自制亚甲基蓝溶液为指示剂、采用针管注射进样、适宜显色时间为10min.此试剂盒达到了快速、直观检测过氧化值的效果，能较好的区分地沟油和正常食用油。此方法与国标检测方法相比，具有简单方便、快速、经济等特点；与酸价快速检测方法相比，具有灵敏、准确、颜色稳定等特点；可用来进行问题油样以及地沟油的快速初筛定性。但距商品化还有一定的距离，还需进一步研究探索，进行优化。
