云香复合胃痛胶囊是浙江省中医院治疗慢性浅表性胃炎(CSG)、功能性消化不良(FD)等疾病的一种自制中药制剂,该药在临床上有较好的治疗效果,但相关机制尚不清楚。笔者通过建立大鼠CSG模型,检测大鼠幽门括约肌组织中一氧化氮合酶(NOS)、乙酰胆碱酯酶(AchE)的活性来初步探讨其对CSG的作用机制。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
清洁级Wistar成年大鼠80只,一级质量标准,雌雄各半,体重(230±20)g,由浙江中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2 药物与试剂
云香复合胃痛胶囊由云母粉、香附、白芍、延胡索(醋制)、海螵蛸、甘草6味中药组成,浙江中医药大学附属第一医院药剂科提供;雷尼替丁由福州海王福药制药有限公司提供(批号:060820);水杨酸钠为上海化学试剂采购供应五联化工厂生产(批号:20040309);NOS测定试剂盒:南京生物工程研究所(批号:20060728);AchE测定试剂盒:南京生物工程研究所(批号:20060824);考马斯亮兰蛋白测定试剂盒:南京生物工程研究所(批号:20060820)。
1.1.3 实验仪器
Au2700自动生化分析仪:日本Olympus公司;RM2135病理切片机:德国Leica公司;BX60型显微镜:日本Olympus公司;DK-S22型电热恒温水浴箱:上海精宏实验设备有限公司;低温高速离心机(Biofuge28RS):上海医用分析仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 动物造模及分组与给药详见文献
1.2.2 检测指标及方法
取大鼠新鲜幽门部胃组织0.5g,加9倍0.9%氯化钠4.5ml,手动匀浆,制成10%的组织匀浆液,继以3000r/min离心10min后,取3ml组织匀浆液放入-80℃冰箱中,待测以下指标:
①幽门括约肌NOS活力的测定:样本及试剂从冰箱取出,37℃水浴3min,进行下列操作,空白管双蒸水a*(50μl);总NOS测定管样本量a*(50μl),2管试剂一底物缓冲液,200μl,试剂二促进剂,10μl,试剂三显色剂,100μl,混匀,37℃水浴准确反应15min,试剂四透明剂100μl,试剂五终止剂2000μl,混匀,530nm处,1cm光径,蒸馏水调零,测吸光度值。
总NOS活力(U/mgprot)=总NOS测定管OD值-空白管OD值/呈物色纳摩尔消光系数×反应液总体积/取样量×1/(比色光径×反应时间)/蛋白含量(mgprot/L)。根据以上公式得出总NOS活力=总NOS测定管OD值-空白管OD值/(38.3×10-6)×(2.41+a*)/a*×1/(1×15)/蛋白含量(mgprot/L)。
②组织AchE活力的测定:取上清液25μl测定AchE活力,操作步骤见表1。
计算公式:组织匀浆中AchE活力(U/ml)=测定管OD值-对照管OD值/标准管OD值-空白管OD值×标准管浓度×样本测试前稀释倍数。
a*为取样量及补足蒸馏水的量。
1.3 统计学处理方法
采用SPSS11.5forWindows统计软件对其进行分析,计量资料以x珚±s表示,采用t检验。
2 结果
各组大鼠幽门括约肌NOS、AchE活性的比较见表2。
3 讨论 在治疗CSG中,NO在炎症过程中具有双重作用,一方面,内皮源性NO具有抑制炎症过程的作用;另一方面,炎症过程后期合成大量NO又可参与炎症反应,具有细胞毒作用,可以导致胃黏膜损伤。NO的这种细胞毒作用被认为是内毒素所致胃肠道损伤的机制之一。
胃肠蠕动和括约肌收缩主要依靠兴奋性神经递质,如Ach、胃动素和P物质等,其中Ach起主要作用,而胃中Ach水平能反应迷走神经活性,为胃肠动力兴奋性递质,具有刺激胃肠肌收缩和促进胃-肠蠕动的作用,还与胃肠腺分泌有关。幽门括约肌是调节和控制胃-十二指肠的消化运动生理功能的“关口”,有较丰富的内源性神经支配系统(ENS)直接支配。
Koch等研究发现迷走神经张力丧失和交感神经活性增加引起胃节律紊乱,这可能是CSG导致胃黏膜损伤的机制之一。
本实验结果表明,实验性CSG大鼠幽门括约肌组织iNOS表达显著高于正常组,各治疗组iNOS表达明显低于模型组,其中云香复合胃痛胶囊中剂量组基本接近正常组。这可能是由于:
①慢性炎症刺激iNOS诱导合成,进而合成大量NO参与胃黏膜局部损伤与炎症反应;②云香复合胃痛胶囊有直接抑制iNOS生成的作用,或可能通过多种途径减轻胃黏膜的损伤与炎症,减少了介导促进iNOS生成的细胞因子,间接抑制了iNOS的合成。
同时,有资料显示:NOS有拮抗Ach的作用,但不影响Ach的释放。本实验研究结果提示实验性CSG大鼠既存在NOS水平升高,也存在AchE活性的增高;Ach释放减少引起胃蠕动减慢、排空低下,而NOS水平升高不仅使神经营养障碍和合成Ach减少,而且能引起胃排空紊乱。这可能是云香复合胃痛胶囊治疗CSG的机制之一。
