线粒体细胞色素氧化酶第一亚基 DNA( mtDNA) 被认为是动物界中最适合的 DNA 条形码标准基因。COI 基因包含丰富的遗传信息，既相对保守又能保证足够变异，进化速率适中，可作为属种系统进化研究的良好标记，目前已广泛应用于昆虫分子系统发育分析。DNA 条码技术已为研究和利用地球上众多的生物资源，鉴定生物多样性提供了强大的工具，并在各物种的鉴定与分类中发挥重要作用。
菱蜡蝉科 Cixiidae 隶属于半翅目 Hemiptera 头喙亚目 Auchenorrhyncha 蜡蝉总科 Fulgoroidea，该科最早由 Spinola( 1839) 建立，目前全世界已记录172 属 2 048 种。该类群昆虫不少种类为农林生产重要害虫，近年来逐渐引起人们的重视和关注。Ceotto 和 Bourgoin首次结合线粒体和核基因对菱蜡蝉科进行分子系统发育分析，研究基于来自 COI、Cytb、18S rDNA、28S rDNA( 2 个非保守区) 基因的 3 652 个碱基，结论是菱蜡蝉科与飞虱科互为姐妹群; 叶文斌等利用 2 个线粒体基因重建蜡蝉总科系统发育关系，主要通过 16S rDNA基因 3'端 400 个碱基以及 Cytb 5'端 120 个密码子对来源于 6 科 10 个分类单元( 16S rDNA 基因是 6科 9 个分类单元) 进行了研究; 近年张培做了中国菱蜡蝉科系统分类研究并描述了4个新种，其中基于 16SrDNA 对菱蜡蝉科 30 种进行了分子系统发育分析，其结果均显示，菱蜡蝉科组成一个单系群。
本文通过对菱蜡蝉亚科 Cixiinae 9 属 17 种昆虫的 mtDNA CO I 基因序列进行研究，验证了 DNA条形码对菱蜡蝉亚科昆虫的识别和鉴定是可行的，测定了 22 条 COI 基因序列，运用 MEGA 5 对序列进行比对和遗传距离分析，基于 COI 基因序列构建ML、MP 、NJ、ME 系统发育树，用以快速、准确地鉴定菱蜡蝉亚科昆虫种类，为进一步研究菱蜡蝉科昆虫分子鉴定技术提供理论依据。
1、 材料与方法
1. 1 供试虫源
所用实验样品分别采自贵州、云南、四川、广西、福建等地 ，采集信息见表1。样本置于1.5 ml 离心管用无水乙醇浸泡，于 －20℃冰箱保存，供实验用。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 总 DNA 提取 样本经解剖、鉴定、编号后，头胸部用于 DNA 提取，腹部及特征结构用于鉴定。采用北京天根 TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒 ( 离心柱型) 进行基因组 DNA 提取，对所提取的 DNA 样本采用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1. 2. 2 PCR 引物 CO I 基因 PCR 扩增使用的引物对是通用引物: 引物由上海生工生物有限公司合成，CO I 引物参考 Herbert，所用引物具体情况见表 2。
1. 2. 3 PCR 反应体系及条件 使用上海生工生物工程有限公司的 2 × Taq PCR MasterMix，每 25 μL反应体系见表 3。95 ℃预变性 7 min; 95 ℃变性 50sec; 50 ℃ 退火 1 min; 72 ℃ 延伸 1 min; 变性延伸重复循环数 35 Cycles; 72 ℃延伸 10 min。
1. 2. 4 PCR 产物测序 PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测时，上样量 4 μL，电泳结果用 Bio － Rad 凝胶成像系统观察、拍照( 图 1) 。PCR 产物检测条带单一、明亮，产物送至上海生工生物有限公司进行测序。每个样品采用正反双链双向测序，提高测序的准确度。
1.3 外群的选择及序列处理分析方法
根据 Bourgoin 等分析了蜡蝉总科中 7 个科的 18S rDNA 序列，其结果显示菱蜡蝉科 + 飞虱科是系统树的最基部分支，并互为姐妹群，Yeh 等基于线粒体16S rDNA 对蜡蝉总科进行系统发育分析，结果显示飞虱科与菱蜡蝉科互为姐妹群; Ceot-to等对菱蜡蝉科进行系统发育分析时外群也选定了飞虱科。本文遵循以上学者的观点，选择褐飞虱 Nilaparvata lugens 作为外群。
每个样品经测序均获得各自的 COI 基因序列，在 SeqMan 软件校对后确定准确无误后，在 NCBI中进行 BLAST 相似性检索，确定目的基因片段。从 GenBank 下载褐飞虱 Nilaparvata lugens 序列 1条作为系统发育分析外群。样品序列 22 条，所用的 COI 序列共计 23 条。
采用 MEGA 5 对 DNA 序列进行比对并进行系统发育分析，计算序列的碱基组成、物种间遗传距离、恒定位点( constant site) ，变异位点( variationsite) 、简约信息位点( pasimony informative site) 、单突变位点( singleton site) 、转换碱基对( transitionalpairs) 。应用邻接法( NJ) 、最小进化法( ME) 、和最大简约法( MP) 构建系统树，使用 Kimura 2 － pa-rameter( K2P) 模型，空位采用成对删除 ( PairwiseDeletion) 策略，自展检验( Bootstrap) 1000 次。
2、结果与分析
2. 1 序列组成和变异
序列组成分析结果显示，17 种菱蜡蝉线粒体DNA COI 基因序列平均碱基组成为: A: 31. 9% 、T:35. 3% 、C: 18. 2% 、G: 14. 6% ，A + T 含量为 67. 2% ，G + C 的含量为 32. 8% ，A + T 含量明显高于 G + C的含量，表现明显的 A +T 碱基偏嗜，且 A 与 T 含量相当，符合昆虫线粒体基因碱基组成的基本特征。经对比后得到 COI 序列长度为 809 bp，其中保守位点 C 118/809，变异位点 v 606/809，简约信息位点 Pi 381/809，自裔位点 S 215/809。
2. 2 碱基替换分析
使用 Mega 5 软件，计算全体位点及各位点的转换与颠换值以及其比值，计算结果如表 4 所示，全体位点的转换主要发生在 A 与 T 之间，转换/颠换比值( R) 为 0. 74。密码子第 1，2 和 3 位点 R 值分别为 0. 84，0. 74 和 0. 67。无论整体还是密码子各位点，其 R 值均小于 2，因此，该段序列转换与颠换未达到饱和，在构建系统发育树时考虑转换和颠换的发生比率; 且说明该段基因可靠度高，使用该基因得到的进化树可靠。COI 序列核苷酸密码子变异情况见表 4。
2. 3 遗传距离分析
采用 MEGA 5 软件基于最大复合概似法( max-imum composite likelihood，MCL) 模型和 Kimura －2 － Parameter( K2P) 双参数模型，分析计算种间遗传距离( 表 5) ，结果表明，外群与 22 个样本之间平均点位差异系数均小于 0. 05，差异显著，外群与内群种之间的进化分歧最大为 0. 068，样本与外群遗传距离介于 0. 502 ～ 0. 645; 属间平均遗传距离为0. 133 介于 0. 102 ～ 0. 147，属内种间平均遗传距离为 0. 047，介于 0. 025 ～ 0. 079 之间; 种内地理类群间平均遗传距离为 0. 039，介于 0. 024 ～ 0. 064 之间，此范围与属内种间遗传距离范围有交集，地理种群间遗传距离差异不明显; 拟甘肃印度菱蜡蝉Indolipa paragansuensis 与基刺库菱蜡蝉 Kuvera ba-sisipina 之间的遗传距离为最大为 0. 319。分析结果说明，属间、种间遗传距离差异较明显，可将此段序列作为分析鉴别物种的依据。
2. 4 系统发育树的构建
采用 MEGA 5 软件基于最大简约法( ML) 、最大简约法( MP) 、邻接法( NJ) 和最小进化法( ME)等构建 4 棵系统树( 图 2 ～5) ，构建树使用 Kimura2 － parameter( K2P) 模型，空位采用成对删除( Pair-wise Deletion) 策略，自展检验( Bootstrap) 1000 次，不同方法构建的系统发育树基本相似。
从图 2 ～5 中可以看出: 所得 4 棵系统发育树拓扑结构之间具有一致性的同时，也存在着一定的差异。盘突贝菱蜡蝉三个地理类群云南、广西、贵州分别为三小支，聚为一支，置信度高达 99、99、100，与南岭贝菱蜡蝉 B. sp1 和峨眉贝菱蜡蝉B. sp2 聚为圆额菱蜡蝉族 Semonini 一支，圆额菱蜡蝉族的另一支库菱蜡蝉属四个种位于树的下部，其中 ML 树显示 K. ussuriensis 和 K. basisipina 聚为一小支( 其置信度高达 100) ，其再与香格里拉库菱蜡蝉 K. shangrilaensis 聚为一支，韦氏库菱蜡蝉K. wvibastei 却未与其聚在一支里，说明该种疏于本属;大菱蜡蝉属两个种小斑大菱蜡蝉M. raimaculatus 和硕大菱蜡蝉 M. grossus 聚为一小支( 置信度高达 100) 与册亨圆口菱蜡蝉 Discoph-orellus cehengsis 靠在一起组成菱蜡蝉族( Cixiini) ，但菱蜡蝉族( Cixiini) 中角突三脊菱蜡蝉 Trihacusgracilisplinus 位于树的中下部远离该族，其与欧菱蜡蝉族( Eucarpiini) 3 个种、安菱蜡蝉族( Andini) 安菱蜡蝉1 个种共同聚为一支; 五脊菱蜡蝉族( Penta-stirini) 两个种基刺瑞脊菱蜡蝉 Reptalus basiproces-sus、拟甘肃印度菱蜡蝉 Indolipa paragansuensis 单独聚为一支位于树的中部; 三叉安菱蜡蝉 Andes sp 与偏伊戴菱蜡蝉 D. excentricus 聚为一小支后与双叉伊戴菱蜡蝉 Dilacreon( Eluzalmon) difurcatus、林氏黑带菱蜡蝉 Kirbyana lini、双叉伊戴菱蜡蝉 Dilacre-on( Eluzalmon) difurcatu、角突三脊菱蜡蝉 Trirhacusgracilisplinus 聚为一大支，说明三叉安菱蜡蝉 Andessp 与该几个类群近缘。
由 4 棵系统树可以看出，由同属组成的一支置信度高，不同属组成的一支置信度低，如库菱蜡蝉属( 基刺库菱蜡蝉 K. basisipina、乌苏里库菱蜡蝉K. ussuriensis) 一支、大菱蜡蝉属( 硕大菱蜡蝉、少斑大菱蜡蝉) 一支、贝菱蜡蝉属( 盘突贝菱蜡蝉、南岭贝菱蜡蝉) 一支近缘程度高，置信度分别高达100% 、99% 和 99% ; 近缘属能聚在一起，但置信度偏低，最低时仅 15%，这与属间、种间、种内遗传距离分析结果具有一致性。虽然遗传距离显示地理种群间差异不明显，并与种间的遗传距离范围有交集，但从系统发育树上能明显看出同一地理种群能聚在一支，且分支置信度高达 98% ～ 100%，说明地理种群之间也发生了遗传分化。结果显示: 菱蜡蝉亚科是单系群，这与张培基于 16SrDNA 序列系统发育树的结果基本一致，与传统分类学上的观点一致，但安菱蜡蝉属一支、库菱蜡蝉属一支与其发育树中对应位置存在一定的差异，有待进一步研究。
3、 讨 论
自 Herbert 等以来，DNA 条形码在昆虫分类中得到了广泛应用。近年来，DNA 条形码技术用于昆虫种类鉴定的报道很多，如常虹等基于线粒体 COI 基因对齿小蠧属昆虫进行研究，结果表明其片段在种间平均遗传距离为 0. 199; 郭锐等做了9 种鹤类 DNA 条形码研究，其研究表明 9 种鹤类的种间平均遗传距离在 0. 124 ～ 1. 218 之间; 黄丽莉等利用 COI 基因对亚洲玉米螟 6 个不同地理类群进行了研究分析，6 个亚洲玉米螟地理种群的平均遗传距离为 0. 012，分歧最大的为 0. 019，最小的为 0. 002。通过比较研究表明，利用 COI 序列进行遗传距离分析及系统发育树构建，并通过属种间遗传距离的分歧大小，可用于区分不同的物种，但利用线粒体 COI 基因 DNA 序列分歧来确定不同地理种群间是否存在差异目前尚无定论，因此，在未来的研究中可采用不同的分子标记方法进一步验证。
通过研究表明，菱蜡蝉亚科属间平均遗传距离为 0. 133 介于 0. 102 ～0. 147; 属内种间平均遗传距离为 0. 047，介于 0. 025 ～ 0. 079 之间; 种内地理种群间平均遗传距离为 0. 039，介于 0. 024 ～0. 064 之间，范围与属内种间遗传距离范围有交集，因此，地理种群间遗传距离差异不明显，但菱蜡蝉亚科昆虫属间、种间已经发生较显著的遗传分化，该片段可以较好的区分菱蜡蝉科昆虫不同物种，研究结果与Herbert 等研究理论一致。基于 COI 基因序列构建的系统发育树显示，同属物种聚为一小支，分支置信度高达 97% ～100%; 同一地理类群聚为一支，分支置信度高达 98% ～100%; 近缘属、种能聚在一起，但置信度偏低，这与属间、属内种间、种内遗传距离分析结果具有一致性。系统发育树也表明地理种群的进化与地理距离存在一定的相关性，虽然遗传距离显示同种物种间地理差异不明显，种间和种内遗传距离范围有交集部分，但是从系统发育树上能明显看出同一地理类群种能聚在一支，且分支置信度高，说明地理类群之间也发生了一定的遗传分化。所得系统发育树结果与传统分类学系统发育树结果基本一致，遗传距离分析等显示该片段基因序列能够区分菱蜡蝉亚科不同物种，因此，应用基于 COI 基因片段的 DNA 条形码对菱蜡蝉亚科昆虫分类鉴定是可行的。
