伊犁黑蜂蜂胶抗菌防龋的效果(2)

　　1.4.3伊犁黑蜂蜂胶对单菌生物膜最低形成抑制浓度 （MBIC50）的测定在96孔板中分别加入菌悬液50μL和含1%蔗糖的BHI液体培养基150μL,依次加入200μL已梯度稀释后的含药BHI液体培养基，37℃下厌氧培养24h.去上清液，PBS清洗3次以去浮游菌，室温下干燥30 min,每孔加入0.1%结晶紫200μL震荡培养20min后吸出，PBS清洗3次，室温下干燥。每孔加入95%乙醇200μL,震荡培养1h后将乙醇吸出至另一96孔板中，酶标仪在A595nm处读数，实验重复3次。生物膜形成抑制率=（1-A595实验组/A595对照组）×100%,生物膜形成最低抑制浓度 （MBIC50）为抑制50%及以上生物膜形成的最低浓度[7].

　　1.4.4伊犁黑蜂蜂胶对单菌生物膜最低清除浓度（MBEC）的测定在96孔板中分别加入菌悬液50μL和含1%蔗糖的BHI液体培养基150μL,置于37℃下厌氧培养24h形成生物膜。吸出96孔板中上清液，PBS洗去浮游菌，加入200μL已梯度稀释后的含药BHI液体培养基，37℃下厌氧培养24h.去除上清 液 后，PBS清 洗 去 除 浮 游 菌， 室 温 下 干 燥30min,每孔加入0.1%结晶紫200μL震荡培养20min后吸出，PBS清洗3次，室温下干燥。每孔加入95%乙醇200μL,震荡培养1h后将乙醇吸出至另一96孔板中，酶标仪在A570nm处读数，MBEC为A值突然升高前的临界值[7-8].实验重复3次。

　　2结果。

　　2.1伊犁黑蜂蜂胶对测试菌株 的 最 低 抑 菌 浓 度（MIC）及最低杀菌浓度 （MBC）结果见表1.课题组在前期实验中发现：伊犁黑蜂蜂胶对所有测试菌株均具有一定的抑制作用，但对放线菌的抑制作用较强，对嗜酸乳杆菌的抑制作用较弱[9].

　　2.2伊犁黑蜂蜂胶对最低生物 膜 形 成 抑 制 浓 度（MBIC50）的测定伊犁黑蜂蜂胶对变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌、粘性放线菌和内氏放线菌的MBIC50值 分 别 为0.39、0.39、0.39、0.05和0.10mg/mL,结果表明，伊犁黑蜂蜂胶在低浓度下能够抑制测试菌生物膜的形成。

　　2.3伊犁黑蜂蜂胶对单菌生物 膜 最 低 清 除 浓 度（MBEC）的测定伊犁黑蜂蜂胶对变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌、粘性放线菌和内氏放线菌的MBEC值 分 别 为6.25、1.56、3.125、0.78和0.78mg/mL,结果表明，伊犁黑蜂蜂胶对所有测试菌株单菌生物膜均具有不同程度的的清除作用。

　　3讨论。

　　如何有效的防治龋病一直是国内外重点研究课题，利用天然药物控制或预防龋病是其研究的热点，而天然药物防龋具有鲜明的地域特性。没食子、黄岑、五倍子、茶、蜂胶等都具有不同程度的防龋能力[8,10-11],其中蜂胶的化学成分极为复杂，且具有异质性。生物膜是细菌最常见的生态环境，与浮游菌相比，菌斑生物膜内的细菌的毒力、耐药性和抵抗宿主免疫防御的能力更强[12].因此为了更全面地评价药物的防龋效果，现关于伊犁黑蜂蜂胶对口腔主要致龋细菌浮游状态生长、菌斑生物膜形成过程中、及对成熟菌斑生物膜影响的作用进行一系列实验研究。

　　通过生长抑制试验发现，伊犁黑蜂蜂胶能有效抑制口腔主要致龋菌的生长，对于不同菌株的抑制效果具有一定差异，并且具有一定的杀灭能力[9].

　　国内外相关研究表明蜂胶对细菌的生长具有抑制作用，Chawalinee等报道蜂胶对变形链球菌的MIC为1.172 mg/mL[13],MBC为4.688 mg/mL;Ghada等研究发现埃及蜂胶和新西兰蜂胶对变形链球菌的MIC分别为100~200μg/mL、5~50μg/mL,新西兰蜂胶对变形链球菌的MBC为100~200μg/mL;对乳 酸 杆 菌 的MIC分 别 为200~400μg/mL、25~50μg/mL,新西兰蜂胶对乳酸杆菌的MBC为200~400μg/mL[14];王晶等发现蜂胶对变形链球菌的MIC为0.078%[15].就目前研究显示，蜂胶的主要抑菌成分是黄酮类化合物，而新疆蜂胶的总黄酮含量低于国内其他地区的蜂胶，其对变形链球菌抑菌效果尚能同国内其他地区蜂胶达到一致[10],其中可能含有其他活性物质或者多物质协同作用[16].

　　赵今等研究表明蜂房对变形链球菌、血链球菌、乳酸杆菌、内氏放线菌和粘性放线菌的MIC为4、2、8、2和1mg/mL,五倍子30%乙醇提取物对变形链球菌、血链球菌、乳酸杆菌、内氏放线菌和粘性放线菌的MIC为2、2、4、2和4mg/mL;周学东等[11]研究发现黄岑对变形链球菌、血链球菌和粘性放线菌的MIC为1、1和0.5mg/mL;根据本实验结果发现伊犁黑蜂蜂胶对致龋菌的MIC浓度低于蜂房、五倍子30%乙醇提取物以及黄岑，提示蜂胶的防龋抑菌效果可能更好。

　　生物膜形成抑制实验结果显示，伊犁黑蜂蜂胶能有效抑制口腔主要致龋菌单菌生物膜的形成。生物膜形成最低抑制浓度 （MBIC50）为抑制50%以上生物膜的最低浓度。伊犁黑蜂蜂胶对变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌、粘性放线菌和内氏放线菌的MBIC50分 别 是0.39、0.39、0.39、0.05和0.10mg/mL,发现在低于测试细菌相对应的MIC浓度时伊犁黑蜂蜂胶已可以抑制50%以上单菌生物膜的形成。变形链球菌、内氏放线菌、粘性放线菌的MBIC50浓度均低于其MIC浓度，说明伊犁黑蜂蜂胶在低于MIC浓度下依然有较强的抑制生物膜形成的能力。

　　生物膜最低清除浓度的实验结果表明，伊犁黑蜂蜂胶能渗透单菌生物膜并杀死膜内细菌，并有效清除口腔主要致龋菌的单菌生物膜，但对于不同的菌株其作用效果具有一定差异[17].MBEC浓度和相应MIC浓度相比高出4~8倍，高于MBIC50浓度4~16倍，但抗生素对细菌生物膜生长抑制的剂量比浮游状态下同种细菌抑菌剂量高100~1 000倍[18-19].相比之下，蜂胶对菌斑生物膜和对浮游菌的抑制作用的浓度相差并不十分明显，甚至在低浓度时即可有效抑制生物膜的形成，在达到一定浓度时可达到清除作用。其对菌斑生物膜的抑制作用机制虽待进一步的研究，但可以肯定的是蜂胶同抗生素相比，毒副作用小，安全性高。

　　药效学研究是正确评价药物对防治疾病的有效性和安全性的基本依据，天然药物防龋药效评价从对口腔 细 菌 作 用 和 对 牙 齿 矿 化 作 用 两 个 层 面 进行[20],在本研究中从药物对浮游细菌、菌斑生物膜形成过程中、及对成熟菌斑生物膜影响，评价黑蜂蜂胶对主要致龋细菌生长的影响，而本课题组将进一步研究，为开发具有防龋潜能的天然药物奠定药效学研究的理论实验基础。

　　参考文献

　　[1]Thirugnanasampandan R,Beena S,Jayakumar RR.Analysis ofchemical composition and bioactive property evaluation of Indianpropolis[J].Asian Pacific J Trop Biomed,2012,2（8）：651-654.

　　[2]Josep Serra Bonvehí，Arrate Lacalle Gutiérrez.The antimicrobi-al effects of propolis collected in different regions in the BasqueCountry（Northern Spain）[J].World J Microbiol &Biotechnol,2012,28（4）：1351-1358.

　　[3]Véronique S,Elham P,David GW,et al.Comparative study of theantibacterial activity of propolis from different geographical and cli-matic zones[J].Phytother Res,2008,22（9）：1256-1263.