伊犁黑蜂蜂胶抗菌防龋的效果

    龋病的防治一直是口腔医务工作者关注的焦点，寻找一种安全有效的防龋制剂是龋病防治领域中的热点。天然药物因毒副作用小、来源丰富、易被人们接受等特点，在龋病预防的应用中越来越受到重视。蜂胶是具有天然生物活性的物质，药理作用广泛，包括抗菌、抗病毒、抗氧化等作用[1-2].蜂胶的成分会因为所处地域、季节和植物的不同而具有多样性和差异性[3-4].本研究采用新疆伊犁黑蜂蜂胶，通过体外实验观察其对口腔常见致龋菌浮游状态生长的影响，对菌斑生物膜形成、及成熟菌斑生物膜的影响，观察伊犁黑蜂蜂胶抗菌防龋的效果并为临床用药及新疆地方药物的应用提供理论依据。

　　1材料与方法。

    1.1药品

    1.1.1新疆伊犁黑蜂蜂胶醇粗提物制备蜂胶采自伊犁尼勒克县种蜂场。将粗蜂胶置于-20 ℃冰箱中24h,取出后在研钵内粉碎，使用水浴法 （m∶v=1∶8）除去蜂蜡，再用冷浸法提纯蜂胶。将除蜡蜂胶粉碎后称取15g,按照固液比1∶5的比例，加入70%乙醇75mL（虽然70%的乙醇具有一定的抑菌能力，但是蜂胶醇溶液在梯度稀释过程中乙醇的浓度也被稀释得极低，蜂胶醇溶液中所含乙醇的浓度早已不具备抑菌的能力），封口浸泡2周后滤去沉渣，干燥沉渣，计算溶液中蜂胶的质量 （蜂胶原重量减去沉渣干燥后的重量），配制成100mg/mL蜂胶醇溶液，用1mol/L NaOH调整pH=7.0后经0.22μm的无菌滤器过滤备用[5-6].

　　1.1.2其他试剂脑心浸液培养基 （Brain HeartInfusion,BHI）、厌氧发生剂、厌氧指示剂：法国生物梅里埃，无菌脱纤维蛋白羊血：新疆医科大学动物实验中心提供，95%乙醇分析纯：天津富宇精细化工有限公司，氯化血红素：上海源叶生物科技有限公司。

　　1.2实验菌株与菌液制备变形链球菌 （Strepto-coccus mutans ATCC 25175）、远缘链球菌 （Strep-tococcus sobrinus ATCC 6715）、嗜酸乳杆菌 （Lac-tobacillus acidophilus ATCC 4356）、 血 链 球 菌（Streptococcus sanguis ATCC 10556）、粘性放线菌（Actinomyces viscosus ATCC 19246）和内氏放线菌（Actinomyces naeslundii ATCC 12104），购买于美国模式培养物集存库 （American Type Culture Col-lection）。将购置的标准菌株接种于BHI血琼脂平板上，于80% N2,20% CO2,37 ℃的条件下厌氧培养48h,进行复苏传代备用。取24h细菌培养液，采用麦氏比浊法测定细菌悬液浓度至3×106备用。

　　1.3仪器生物安全柜：Thermo公司，型号1300SERIES A2;37℃恒温培养箱：上海博讯实业有限公司，型号BS124S;全波长酶标仪：Thermo Mul-tiskana Spectrum;厌氧罐：日本三菱株式会社；电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司。

　　1.4方法

　　1.4.1最低抑菌浓度 （MIC）测定根据临床实验室标 准 化 协 会 （Clinical and Laboratory StandardInstitute,1997）所制定的标准，选用液体稀释法测定不同菌株的MIC.

　　（1）取编号为1~10的无菌玻璃试管，每支试管中加入等量的BHI液体培养基1.0mL备用。

    （2）往第1支试管中加入100mg/mL蜂胶醇提物1.0mL,混匀后吸取1.0mL混合溶液加入2号试管，即使用二倍稀释法依次稀释蜂胶醇提物至10号管；同时设立阳性对照组 （即不含蜂胶醇提物的菌液培养基）和阴性对照组 （即不含蜂胶醇提物也不含菌悬液的BHI培养基）。（3）往1~10号试管中等量加入测试菌悬液100μL.

　　（4）将上述所有试管用无菌橡皮塞塞紧并严密封口，置于80% N2,20% CO2,37℃恒温箱培养48h.

　　（5）所有试管将在黑色背景下观察，比较试管中液体的浑浊情况，肉眼观察试管内液体清亮无混浊或沉淀生长的最低药物浓度为该药的最低抑菌浓度。 （6）若有因药物沉淀导致结果不易判定的试管，混匀后吸取少量培养物接 种 于BHI琼 脂 培 养 基 上，80% N2,20%CO2,37℃下厌氧培养48h,观察是否有菌落生长。每种测试菌MIC实验重复3次。

　　1.4.2最低杀菌浓度 （MBC）测定选取肉眼观察无细菌生长的试管，使用无菌接种环挑取试管中中的 培 养 物，接 种 于BHI琼 脂 平 板，80% N2,20% CO2,37℃下厌氧培养48h后观察平板，无细菌生长的最低浓度即为MBC.MBC实验重复3次。