牙周炎是一类累及牙齿周围组织的感染性病变，其特点是炎症破坏牙周支持组织，导致牙周袋的形成及牙槽骨吸收最终造成失牙。研究发现许多免疫因子的基因多态性与侵袭性牙周炎、慢性牙周炎的易感性密切有关，如 TNFα、IL － 6、IL － 10等。CTLA －4 作为免疫反应中重要的负性调控因子，对于其基因多态性与牙周炎的关系还不是十分清楚。为进一步探明 CTLA － 4 基因多态性与中国人群中的侵袭性牙周炎、慢性牙周炎的关系，我们检测了 55 例慢性牙周炎、48 例侵袭性牙周炎以及 80例健康者中的 CTLA －4 +49A/G、－318C/T 位点基因多态性分布，并进行相关统计学分析。
1 材料与方法
1． 1 研究对象: 选自 2011 － 09 ～ 2012 － 11 期间就诊于我院口腔科患者，诊断均符合牙周病分类国际研讨会制定的基于全口牙周袋深度( PD) 和牙周附着丧失( CAL) 的分类诊断标准，均无明显的颌面畸形及相关局部刺激因素，无糖尿病、心血管疾病等系统性疾病，无吸烟史。其中慢性牙周炎 55 例，男35 例，女 20 例，年龄( 40． 7 ± 10． 2) 岁; 侵袭性牙周炎48 例，男30 例，女18 例，年龄( 31． 2 ±8． 3) 岁; 健康对照组为牙周健康、无口腔及系统性疾病 70 例，男 39 例，女 31 例，年龄( 38． 7 ±7． 9) 岁。
1． 2 样本采集及 DNA 提取: 采用 Chelex － 100 法从颊膜拭子中提取 DNA: 用无菌棉签取双侧颊黏膜拭子，自然干燥过夜，无菌密封保存。随后取拭子表层，加入浓度为5%的 Chelex －100 溶液150 μl 浸没黏膜拭子，加入 20 mg/ml 的蛋白酶 K 4 μl，漩涡混匀，40 ℃水浴消化过夜后煮沸 10 min，并置于冰上冰浴 3 min，低温离心机 14 000 rpm/min 离心2 min，取上清后 －20 ℃保存。
1． 3 CTLA － 4 + 49A /G 基因型测定: 采用多聚酶链反应 － 限制性内切酶片段长度多态性 ( PCR －RFLP) 法检测基因型: 上、下游引物分别为 5’－ GCTCTA CTT CCT GAA GAC CT － 3 ’，5 ’－ AGT CTCACT CAC CTT TGC AG － 3’，引物由上海生工公司设计合成; PCR 反应试剂盒购于 Takara 公司，反应体系为 20 μl，其中 DNA 5 μl，MgCl20． 5 μl，上下游引物各 0． 5 μl，Taq 酶 2 U，10 × 缓冲液 2 μl，用ddH2O 补足至 20 μl; 反应程序设置为: 预变性 95℃10 min，95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，30 个循环，最后72℃10 min 延伸; PCR 反应产物为162 bp 的目的基因片段; 酶切反应: 162 bp 的 PCR 扩增产物 8 μl，加入 BbvI 限制性内切酶( NEB 公司) 5 μl，再加入10 × 缓冲液 1． 5 μl，后于 37℃ 酶切 12 h; 酶切产物用 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，硝酸银染色进行基因型鉴定; CTLA － 4 + 49A/G 基因扩增片段为 162 bp，酶切后获得 88/72 bp 片段的为等位基因 G，仍为 162 片段的是等位基因 A，兼有二者的为杂合子。
1． 4 CTLA － 4 － 318C /T 基因型测定: 方法如上所述，其上下游引物为为 5’－ AAA TGA ATT GGACTG GAT GGT － 3’，5’－ TTA CGA GAA AGG AGGCCG TG － 3’; PCR 扩增产物片段为 247 bp，Mse I 限制内切酶酶切以后获得 226/21 片段的为等位基因C，获得 130 /96 /21 片段的为等位基因 T，二者兼有者为杂合子。
1． 5 统计学分析: 直接计算法计算出基因频率和基因型频率，采用 χ2检验进行各组基因型 Hardy －Weinbery 平衡吻合度检验; 等位基因与基因型频率之间的差异通过 χ2检验进行分析。
2 结果
2． 1 CTLA － 4 外显子 1 第 49 位点 A /G 基因多态性与牙周炎关系: 如表 1 所示，3 组的基因分布均符合 HWE; 正常对照组与慢性牙周炎组比较结果显示，等位基因 G 在慢性牙周炎组的患者中频率显着高于健康对照组( P ＜ 0． 05，OR = 1． 84，95% CI1． 09 ～ 3． 09) ; 而在基因型比较中发现，基因型 GG在慢性牙周炎患者中的频率同样高于对照组，二者具有显着的统计学差异( P ＜0． 05，OR =2． 15，95%CI 1． 07 ～ 4． 33) ，但基因型 AA 在二组间的表达水平却不具有显着的统计学差异( P ＞ 0． 05，OR =0． 45，95% CI 0． 17 ～ 1． 24) ，提示等位基因 G 及基因型 GG 可能是慢性牙周炎的易感因子。而对于急性牙周炎而言，结果并未发现等位基因 G 或基因型GG 的频率在急性牙周炎患者中存在显着的差异。【表1】
2． 2 CTLA － 4 基因启动子区 318 位点 C /T 基因多态性与牙周炎关系: 如表 2 所示，与 CTLA － 4 +49A / T 相似，3 组中的 HWE 检验均 ＞ 0． 05; 而对于牙周炎患者中 － 318C/T 等位基因与基因型频率的分析结果显示: CTLA －4 －318C/T 的基因多态性与侵袭性牙周炎、慢性牙周炎均无明显的相关性( P ＞0． 05) ，提示该位点可能在牙周炎的发生中并非独立的危险因素。【表2】
3 讨论
尽管当前人们已经认识到导致牙周炎发生的许多危险因素: 如吸烟、糖尿病、心血管疾病、药物、激素等，但是对于牙周炎具体的发病机制仍不是十分清楚，虽然牙周菌斑微生物被认为是引起牙周炎发生、发展的重要始动因子，但是研究证实宿主的基因遗传背景是导致个体对牙周炎的易感性差异的最重要原因。由于宿主遗传背景不同导致机体在炎症反应、免疫反应出现差异，进而引起机体对牙周微生物免疫应答不同，最终在不同的个体表现出对牙周炎的差异易感性; 单基因多态性是个体遗传因素中重要的一环，当前研究认为许多免疫相关因子的基因突变会引起免疫因子表达或功能异常，进而引起机体免疫状态改变，引起疾病的发生。在以往的研究中，许多研究已证实细胞因子的单基因突变是决定机体对牙周炎易感性的重要因素，如 TNF － α、IL － 6、IL － 10 等。
CTLA － 4 作为免疫球蛋白超家族成员之一，与 CD28 具有结构同源性，在 T 淋巴细胞激活过程中能与 CD28 分子竞争结合 B7，阻滞激活 T 淋巴细胞的第二信号的传递，负向调控 T 细胞活化促进 T 细胞凋亡; 而 CTLA －4 基因外显子区及启动子区多态性被认为与 CTLA － 4 的表达水平以及功能的发挥密切相关，如 CTLA －4 外显子1 中第49 位点等位基因 G 的频率增加时会导致 CTLA － 4 抑制 T 细胞活化的功能降低; 而 CTLA － 4 启动子区 － 318 位点的 C/T 多态性同样被认为可影响 CTLA － 4 分子表达及其调控功能． 在本研究中，我们通过分析侵袭性牙周炎、慢性牙周炎患者与健康对照组 CTLA － 4+ 49A / G 及 CTLA － 4 － 318C / T 的基因分布，发现CTLA － 4 + 49A / G 与慢性牙周炎的发生有显着相关性，而该位点的相关基因频率与等位基因频率在侵袭性牙周炎患者中均无明显差异; CTLA －4 －318C/T 基因多态性在 3 组间的分析发现: 无论是在侵袭性牙周炎还是慢性牙周炎中，CTLA －4 －318C/T 的多态性与疾病的易感性无显着相关。
研究认为，当 CTLA － 4 外显子 1 第 17 密码子49 位点发生基因突变时，CTLA － 4 信号肽中苏氨酸与甘氨酸发生替换，引起 CTLA －4 蛋白亚细胞定位异常，影响新生肽链与分子伴侣之间的作用，导致CTLA － 4 在折叠过程发生异常，最终导致功能变化; 此外，除了导致 CTLA －4 功能异常外，等位基因 G 还可以使内质网在加工处理 CTLA － 4 过程中使糖基化蛋白的产生与表达降低，最终导致正常的CTLA － 4 的表达下调功能丧失。在本研究中，我们发现在慢性牙周炎患者中，等位基因 G 以及基因型 GG 的频率显着高于健康对照组，推测其可能是导致 CTLA －4 表达下调，抑制 T 细胞活化的功能丧失，引起 T 细胞的活化与增殖最终引起机体慢性炎症( 慢性牙周炎) 的原因; 而在巴西人群中的研究同样发现 CTLA － 4 + 49 等位基因 G 的频率在慢性牙周炎中显着高于对照组，与本研究结果一致，尽管在巴西人群中 CTLA －4 外显子1 第17 密码子49 位的等位基因 G 的频率显着低于中国人群( 28． 0% vs58． 1% )。而在另一项研究中，Wohlfahrt 等在美国人群中却未发现 +49A/G 基因多态性与慢性牙周炎的易感性存在明显的阳性关系，这进一步说明了基因多态性对疾病的发生与发展在不同种群中的作用可能不尽相同。此外，本研究所发现的 －318C/T 与牙周炎易感性的阴性关系同样在巴西人群得到证实，这说明 CTLA －4 －318C/T 基因多态性可能与牙周炎的发生、发展无关，但仍需要在其他种群中进一步研究证实。
本研究中我们并未发现 CTLA －4 +49A/G 基因多态性与侵袭性牙周炎的易感性有关，但 Silva 等的研究中发现等位基因 A 与侵袭性牙周炎的发病显着相关，分析可能原因: 一是种族的差异; 二是 Silva研究中纳入的侵袭性牙周炎患者未排除吸烟这一危险因素，而在本研究中我们纳入的标本均为无吸烟史的侵袭性牙周炎患者; 三是样本量不同，在 Silva研究中共纳入 105 例侵袭性牙周炎患者，而本研究所纳入的标本量只有 48 例，小样本可能会带来一定的统计误差。所以对于中国人群中 CTLA －4 +49A/G、－ 318C / T 的基因多态性与侵袭性牙周炎的关系仍需要在相对大的样本量中进一步证实。此外，将来的研究还应该集中于这些异常的基因多态性与牙周炎的临床症状、治疗疗效等的关系，为将来这些基因多态性走向临床成为牙周炎诊断、治疗的一种新的策略提供理论基础。
总之，本研究通过检测牙周炎患者与健康对照者之间 CTLA －4 + 49A/G、－ 318C/T 的基因多态性分布，发现 CTLA － 4 + 49 等位基因 G 及基因型 GG在慢性牙周炎患者中的频率显着高于对照组，提示二者可能是慢性牙周炎的易感因素; 但对于 CTLA －4 的基因多态性与慢性牙周炎的发病机制、临床特征的关系仍需要进一步的研究证实。
【参考文献】
［1］刘 骁，李 禹． 牙周炎的病因及危险因素的相关研究进展［J］． 中国实用医药杂志，2009，4( 24) : 99 －100．
［2］曹采方，孟焕新，阎福华． 牙周疾病新分类简介( 1999 年国际研讨会) ［J］． 中华口腔医学杂志，2001，36( 5) : 391 －393．
