大鲵 (Andrias davidianus)属两栖纲有尾目(Caudata)隐鳃鲵科(Cryptobrachidae)大鲵属(An-drias),俗称娃娃鱼.大鲵是世界上现存的个体最大的两栖类爬行动物,属于国家二类野生保护动物,已被列入CITES公约附录Ⅰ中.自1978年报道首例大鲵人工繁育成功以来[1],我国许多有大鲵自然分布的地区都积极开展了大鲵的人工繁育和养殖.然而,随着大鲵养殖规模的不断扩大以及集约化程度的提高,有关大鲵养殖病害的报道逐年增加.研究表明,养殖大鲵病害的病原主要包括细菌、病毒及寄生虫等[2-4].2010年以来,陕西省汉中、商洛等地区养殖大鲵发病,死亡率达90%以上.病鲵主要临床症状包括体表溃疡、局部有出血点以及后肢和头部肿大等.
尸体剖检后发现病鲵肺脏、肾脏表面出现多处大小不一的囊性病变,其他病变不明显.为查明引起病鲵肺脏、肾脏囊肿的病原,无菌条件下分别从病鲵肝脏、肺脏、肾脏等部位分离细菌性病原,从肝脏分离到一株弗氏柠檬酸杆菌,肺脏和肾脏未分离到致病菌.将自然发病大鲵的内脏组织固定后进行了病理组织切片和超薄切片观察,并在此基础上进行了分子生物学研究,综合试验结果判定引起病鲵肺脏、肾脏囊肿的病原是大鲵虹彩病毒.现将研究结果详细报道如下,希望对于大鲵疾病的临床诊断和防控提供一定的参考.
1材料与方法
1.1材料
病鲵采自陕西省汉中、商洛等地的大鲵养殖场,体质量2.0kg~3.5kg;脑心浸液(BHI),北京陆桥生物制品有限公司产品;25g/L戊二醛,Sigma公司产品;Amp,天根生化科技(北京)有限公司产品;ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、Marker DL 2 000,病毒DNA提取试剂盒、MiniBEST Plasmid PurificationKit、Agarose gel DNA Fragment Purification Kit、T4DNA连接酶、感受态细胞DH5α,宝生物工程(大连)有限公司产品;pMD18-T simple载体,Pro-mega公司产品;其他试剂均为国产分析纯.
1.2方法
1.2.1细菌分离与鉴定
取症状典型的濒死大鲵,参照文献[5]的方法以无菌操作从肝脏、肺脏、肾脏取样进行BHI平板划线分离,置30℃培养,24h后观察.待菌落形成后进行纯化,然后将纯培养物按说明书操作利用全自动微生物鉴定仪(Biolog,Om-ilog GEN,USA)进行细菌鉴定.
1.2.2 组织病理切片制备与观察
取病鲵的肝脏、肾脏、肺脏等组织,用Bouin液固定24h,酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋、切片,HE染色,光镜观察.
1.2.3超微切片制备与观察
取病鲵的肝脏、肾脏、肺脏等组织,切成1.0mm3大小的小块,经25g/L戊二醛固定,乙醇脱水,环氧树脂包埋,用LeicaCM1950超薄切片机制备厚度为50nm~80nm的超薄切片,置于有支持膜的铜网上,醋酸铀及柠檬酸铅染色后在H-7650型透射电镜80kV下观察.
1.2.4 基因扩增与序列测定
将处理后的病鲵肝脏、肺脏、肾脏等组织按照病毒核酸提取试剂盒说明书进行病毒核酸的提取.根据GenBank已发表的蛙病毒属的代表种FV3主要衣壳蛋白(mcp)基因高度保守区序列(GenBank登录号:AY548484),应用Primer5.0和Oligo6.0设计一对引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.引物序列如下:P1:5′-CCGATGTCTTCTGTAACTGGTTC-3′;P2:5′-CCCTTACAAGATTGGGAATCCCA-3′.
以提取纯化的病毒DNA为模板进行扩增,总体积为25μL的反应体系为:0.25μL TaKaRa ExTaq(5U/μL),2.5μL10× Ex Taq buffer(Mg2+Plus),0.25nmol/L dNTPs 1.0μL,引物(50pmol/L)各0.5μL,DNA模板3μL,ddH2O补充至25μL.反应条件为:95 ℃ 3min;95 ℃ 30s,52 ℃ 30s,72℃1.5min,30个循环;72 ℃充分延伸10min.10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.
经PCR反应获得的目的基因通过胶回收试剂盒回收后,按10μL反应体系,依次加入纯化PCR反应产物4μL,pMD 18-T simple载体1μL,连接缓冲溶液5μL.16 ℃连接2h,取连接产物转化DH 5α感受态细胞,涂布含Amp的LB平板,37 ℃培养12h~16h后,挑取5个~6个白色菌落抽提质粒,PCR扩增挑选阳性克隆.阳性克隆委托北京天一辉远生物科技有限责任公司测序.测序结果在GenBank中进行比对,分析病毒的进化关系.
2结果
2.1临床病变
病鲵活动力减弱,食欲减退,且常会吐出所食食物;体表有溃疡,四肢尤其后肢肿大,头部肿大;体表局部有出血点.患病大鲵以成鲵和种鲵为主,多会在发病后7d~10d死亡.剖检后,可见淡黄色腹水,肺脏和肾脏出现囊肿(图1A、图1B),肺脏囊肿尤为明显和严重.囊肿的数量不等,直径1mm~3mm,触摸其质地较周围组织硬.
2.2细菌的分离
从病鲵的肝脏分离到一株细菌.经Biolog全自动微生物鉴定系统鉴定,该菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii). 各 项 参 数 为:PROB=0.967;SIM=0.596;DIST=6.024.从肺脏和肾脏均未分离到致病菌.
2.3病理组织切片观察
光镜下观察,肝细胞出现广泛性空泡变性,肝细胞肿胀,体积增大,胞浆内出现大小不等的空泡;肝细胞胞浆内可见嗜酸性包涵体,肝小叶间淋巴细胞浸润(图2A).支气管、细支气管及终末性细支气管黏膜上皮下毛细血管扩张,充满红细胞(图2B),肺间质中小血管和毛细血管扩张充血.肾小管上皮细胞肿胀,胞浆浑浊,胞浆可见微细的蛋白质颗粒;部分上皮细胞肿胀,突入管腔,管腔狭窄;也有部分上皮细胞变性、坏死,脱落掉入肾小管管腔(图2C).
2.4超薄切片观察
肺脏和肾脏组织可见大量聚集或分散的病毒颗粒(图3A).病毒颗粒切面呈正六边形,直径为148nm~151nm(图3B).病毒颗粒外有衣壳包绕,衣壳电子密度较低,病毒核心电子密度较高,部分病毒仅有衣壳而无核心,呈空心颗粒.另外,病变部位充满了大量的细胞碎片、空泡样物质(图3A)"微丝"样结构(图3C)以及不定型物质,细胞结构紊乱.肾小管上皮细胞水肿、溶解,细胞内可见结晶样包涵体(图3D).
2.5病毒mcp基因扩增与序列分析
以病鲵的内脏组织DNA为模板,采用引物P1和P2通过PCR方法扩增病毒mcp基因,产物经电泳检测大小为1 392bp(图4).测序结果及推导的氨基酸序列见图5.将测序所得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列在GenBank中进行比对,结果表明本研究分离病毒的核苷酸和氨基酸序列与已报道的大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,CGSIV,KF023635)的同源性均为99.0%.因此,可以确定本研究分离的病毒为大鲵虹彩病毒,在分类地位上属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus).
3讨论
近年来,由大鲵虹彩病毒引起的养殖大鲵病毒性疾病呈现明显的上升趋势,给大鲵养殖造成了重大的经济损失,严重阻碍了大鲵养殖业的健康发展[6].研究表明,自然感染大鲵虹彩病毒的病鲵主要症状为:皮肤和口部溃疡、头部肿胀、远端肢体的肿 大并最终坏死以及下颌、腹部的充血、出血等;剖检后发现多数组织器官出现病理损伤,尤其是肠道、肝脏、肾脏、脾脏及肺脏的损伤尤为严重.主要表现为严重的变性、坏死与炎症反应,导致机体多组织器官功能障碍,乃至衰竭,最终引起死亡[7].这些临床症状与国内外观察到的虹彩病毒感染其他两栖动物的病理变化基本一致[8-9].但是,由于感染大鲵虹彩病毒而导致养殖大鲵的肺脏、肾脏出现囊肿的病例未见报道.
本研究从患病大鲵的肝脏分离到一株弗氏柠檬酸杆菌,而从肺脏、肾脏等病变部位并未分离到任何致病菌.组织病理学观察结果与已往观察到的大鲵感染虹彩病毒后组织病理变化基本一致.超薄切片的透射电镜观察结果显示,在肺脏、肾脏病变部位可见聚集或分散的病毒颗粒.病毒颗粒具有囊膜,切面呈正六边形,对角直径在148nm~151nm.病毒颗粒的形态结构与虹彩病毒极为相似,而且分离病毒mcp基因的核苷酸和氨基酸序列与已有研究报道的大鲵虹彩病毒同源性均在99.0%.因此,本研究分离的病毒即是大鲵虹彩病毒.
根据超薄切片电镜观察结果可知,病鲵肺脏、肾脏病变部位存在大量聚集或分散的大鲵虹彩病毒颗粒,未见到任何细菌菌体.从已报道的病例看,造成两栖动物和鱼类内脏出现类似症状的病原主要包括细菌和病毒.细菌性病原有诺卡菌[10]、嗜水气单胞菌[11]、舒伯特气单胞菌[12]等.由细菌引起的类似病变部位在电镜下可见到大量细菌菌体,被包膜所包裹[13].而在本研究中,病鲵肺脏、肾脏囊肿病变部位超薄切片中未发现任何致病菌菌体;同时研究表明,病鲵肝脏分离出的弗氏柠檬酸杆菌也不可能引起患病大鲵的肺脏、肾脏出现囊肿这样的病理变化[14].因此,可以判定,引起病鲵的肺脏、肾脏出现囊肿的病原不是弗氏柠檬酸杆菌,应是大鲵虹彩病毒.
现有研究表明,虹彩病毒科的多种病毒可感染水生动物后引起受感染动物的内脏组织或皮肤等出现肿 大 或 囊 肿 等 病 理 变 化. 细 胞 肿 大 病 毒 属(Megolocytivirus)病毒可造成大口黑鲈(Micrope-rus salmoides)、云斑尖塘鳢(Oxyeleotris marmora-tu)的肝脏、脾脏、肾脏等内脏器官肿大[15-16].此类疾病的组织学结果显示病鱼的脾脏、肾脏及肝脏等病变部位有大量肿大细胞.淋巴囊肿病毒属病毒可以引起鱼类的皮肤出现囊肿病变[17].鱼类淋巴囊肿病的主要发病部位为皮肤,内脏部位较少出现.其病变组织是一些淋巴囊肿细胞的集合体,囊肿细胞内含有大量病毒粒子[18].本研究的超薄切片观察结果显示,病鲵的肺脏、肾脏囊肿部位除了大量成熟的大鲵虹彩病毒外,还存在许多空泡、"微丝"样结构以及大量的细胞碎片.
这些空泡和"微丝"结构是病毒在大量增殖过程中感染细胞内出现的特有结构或物质[19].另外,在肾小管上皮细胞可观察到结晶状排列的病毒颗粒.这些均表明病毒正在病变部位大量增殖.出现的细胞碎片及其他不定型物质也说明已有许多细胞受到病毒感染后凋亡解体.因此,可以进一步确定患病大鲵的肺脏、肾脏囊肿是由于病毒感染形成的.至于囊肿形成的机制可以推测认为,大鲵虹彩病毒感染病变部位组织后,引起细胞的凋亡、解体和细胞内容物的释放,再加之大鲵体内免疫系统发挥作用后免疫细胞抵抗病毒感染而形成的一些病理性产物而形成的.因此,受到大鲵虹彩病毒的感染而造成大鲵的肺脏、肾脏等内脏器官出现囊肿的致病机制与细胞肿大属病毒和淋巴囊肿病毒属病毒尤其是淋巴囊肿病毒属病毒应该有所差异.当然,感染大鲵虹彩病毒导致大鲵肺脏、肾脏囊肿形成的详细机制还需进一步深入研究.
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