喹乙醇属于喹恶啉类抗菌药,本类药物具有广谱抗菌、促进生长双重作用.广泛用于猪、牛、鸡、羊的促进生长,抗菌治病和水生动物疾病的防治,提高能量物质和蛋白质的利用率,增加体内蛋白质的合成等.20世纪70年代以来曾在世界范围内被广泛应用,卡巴氧和喹乙醇为2个代表性品种.考虑到喹乙醇及其代谢物3-甲基-喹啉-2-羟酸会在动物体内产生残留,并对人类健康存在潜在危害,我国也已出台相应的政策、法规及测定标准[1].目前,喹乙醇在猪[2]、鸡[3]和老鼠[4]等体内的研究有见报道,在水产动物上的研究报道很少.近年来,喹乙醇在水产养殖行业使用频繁,本文建立了水产品中喹乙醇的LC-MS/MS检测方法并对喹乙醇在鲫鱼体内的药代动力学进行了研究,这对水产养殖合理用药以及保障我国食品安全具有意义.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 试剂与药品喹乙醇,含量为99.0%,CAS号:23696-28-8,Sigma公司产品;甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯(Merck),其他试剂均为广州化学试剂厂生产的分析纯,水为超纯水.
1.1.2 仪器和设备 Agilent 1290高效液相色谱仪,Agilent 6460Triple Quad LC/MS三重四极质谱仪、配有电喷雾离子源;Hitachi CR22GⅡ离心机;Zymark TurboVapLV浓缩站;Siemens冰箱;恒温水浴振荡器等.
1.1.3试验用动物试验用鲫鱼,购自珠海一源水产品养殖场,体重250g±20g,抽样检查无喹乙醇残留,养在玻璃缸内10d后用于试验,试验在6个水体分别为20L的方形玻璃缸中进行,试验期间不断充气并对水体进行循环过滤,水温控制在20℃~25℃,试验期间每日早晚投喂适量鲫鱼饲料各1次,及时排出残饵和粪便,每2d换水1/2体积,随机分成2组,分别为经口灌服组和对照组,试验期间鲫鱼成活率为100%.
1.1.4 给药和血样采集按30mg/kg体重给药,分别于经口灌服后0、0.167、0.75、1、2、4、8、12、24、36、48、96h采血,鲫鱼用抄网捞起,用湿毛巾裹住鱼体,尾静脉取血0.3mL,放入离心管(离心管事先放入2滴10g/L的肝素钠),混合均匀后离心分离血浆,用于血药浓度的测定.样品于-20 ℃冰箱保存.
1.2方法
1.2.1 样品处理从冰箱中取出血浆样品,恢复室温,取0.1mL血浆加入0.9mL 30g/L的三氯乙酸,振荡混匀2min,80℃水浴5min,10 000r/min离心5min,吸取上清液过0.22μm滤膜(水相),用于LC-MS/MS测定.
1.2.2 色谱条件色谱柱为Agilent Eclipse plusC18PRHD 2.1×50 mm,1.8μm;流 动 相A为5mmol/L乙酸铵(含1mL/L甲酸),流动相B为乙腈,梯度洗脱;流速为0.2mL/min;柱温为30℃±1℃;进样量为10μL(表1).
1.2.3 质谱条件离子源(Source):ESI(+);GasTemp:325 ℃;Gas Flow:5mL/min,Nebulizer:50psi,Sheath Gas Temp:350 ℃,Sheath GasFlow:10 L/min,Capillay:4 000 V;裂 解 电 压(Fragmentor)、碰撞能(collision energy)见表2;Q1和Q3均为单位分辨率.检测方式为多反应监测(MRM)模式.
1.2.4 标准曲线将喹乙醇标准工作液依次稀释得到0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.200、0.500μg/mL的标准系列,由低到高的浓度进行测定,以标准溶液浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标绘制标准曲线.
1.2.5 回收率及精密度在空白血浆中添加喹乙醇浓度0.005、0.010、0.05μg/mL,每个浓度6个重复,按1.2.1处理方法进行处理后上机测试.
1.2.6 数据分析喹乙醇在鲫鱼体内处置过程采用房室模型分析,药动学参数同时采用房室模型和统计矩原理来推算,模型的拟合和参数的推算采用统计软件3P97.
2结果
2.1标准曲线及最低检测限准确稀释浓度为1.0μg/mL的喹乙醇标准溶液,按照1.2.3条件对其进行全扫描,喹乙醇准分子离子及对准分子离子进行二级全扫描分析所得碎片离子图(图1).在建立的色谱质谱条件下,喹乙醇在0.001μg/mL~0.500μg/mL浓度范围内,峰面积(y)与浓度(x)呈良好线性关系,回归方程分别为y=133.702 6x+108.306 3(r²=0.999 7).喹乙醇的最低检测限为0.001μg/mL.
2.2回收率及精密度的测定喹乙醇的添加回收率分别是71.6%±4.1%、78%±3.6%和81.5%±4.2%,批内和批间变异系数均小于10%.
2.3喹乙醇在鲫鱼血浆中的药动学特征鲫鱼单剂量经口灌服给药后,不同时间血药浓度的实测值见表3,血浆喹乙醇浓度-时间曲线如图2所示,喹乙醇在鲫鱼血浆中最佳药物动力学模型为一级吸收一室模型,药物动力学参数见表4.
3讨论
喹乙醇常用于淡水养殖鱼类疾病的防治和促生长,且具有十分明显的抗菌促生长的效果,成为少数几个水产养殖中的抗菌促生长剂之一.喹乙醇在常温下水溶性很差,但可在动物肠道中被迅速吸收,研究表明,喹乙醇在动物体内代谢过程中大约有70%以原形物质的形式从体内排出.本试验对鲫鱼血浆中喹乙醇代谢物进行了研究,旨在反应喹乙醇在鲫鱼体内的动态规律.
鲫鱼以30mg/kg经口灌服给药后,Ka为0.65h^-1±0.085h^-1,T1/2kα为1.09h±0.14h,说明喹乙醇口服吸收较快,在给药后0.0167h~4h,血浆中喹乙醇质量浓度几乎成直线上升,Tmax为3.25h±0.41h,Cmax为25.73mg/L±2.53mg/L,说明喹乙醇口服吸收良好,适用于防治淡水养殖鱼类细菌出血性败血症、疖疮病等疾病[5].随后喹乙醇血药质量浓度迅速下降,消除半衰期 (T1/2)为Ke5.97h±1.06h,到48h时血药质量浓度为54.1μg/L左右,96h血药质量浓度为3.0μg/L左右(图2).艾晓辉等[6]通过经口灌服给药方式一次性给予鲤鱼30mg/kg的喹乙醇,试验发现喹乙醇在鲤鱼体内的数据符合一级吸收一室开放模型,与本研究消除特征相似.喹乙醇在鲫鱼体内消除速度比与鸡[7]、兔[3]、鼠[4]慢,吸收比鸡[7]、兔[3]慢,达峰时间与鲤差异不大,比鸡、兔、鼠慢.
目前,喹乙醇的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)[8-9]、气质联用法(GC-MS)和液质联用法(LC-MS/MS)[10-13]等.由于LC-MS/MS法具有灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强等优点,因此是理想的喹乙醇残留分析方法.已报道的LC-MS/MS法多采用正离子方式进行采集,得到的一级质谱分子离子为m/z 264.2,二级质谱子离子主要是m/z246.2,221.1,212.2,177.2,160.2,143.2(图1)等,其中m/z 246.2为脱H2O,m/z 221.1为喹乙醇失去C2H5N的碎片离子,m/z 212.2为m/z 246.2两次脱去OH的碎片离子,m/z 177.2是喹乙醇脱去C3H5NO2的碎片离子,m/z 160.2是m/z 221.1失去CHO3的碎片离子,m/z 143.2是m/z 212.2失去C3H5NO的碎片离子,选取丰度最强的两个子离子m/z 143.2和m/z 212.2,获得了较高的灵敏度,且方法重复性很好,与本研究采用的方法相同.
参考文献:
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