水产检疫论文优秀范文推荐6篇之第五篇：液相芯片技术在水产品检疫性病毒检测技术中的运用
摘要：液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的， 集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统化学技术为一体的新型生物分子检测技术。具有高通量、高灵敏度、高准确度、高精密度、宽的线性范围及操作简便等众多优势， 可用作蛋白质和核酸等生物分子的高通量检测平台。现对液相芯片的发展、原理及该技术在水产品检疫中的应用前景作一简介。
关键词：液相芯片； 水产品； 检疫；
液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术， 属于生物芯片的一种。液相芯片， 也称为微球体悬浮芯片 （suspension array, liquid chip） , 是基于xMAP （flexible Multi-Analyte Profiling） 技术的新型生物芯片技术平台[1,2,3], 它是在不同荧光编码的微球上进行抗原-抗体、酶-底物、配体-受体的结合反应及核酸杂交反应， 通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的， 一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应[4], 是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。迄今为止10年时间， 全球已有数百套基于xMAP技术的检测平台用于免疫学、蛋白质、核酸检测、基因研究等领域， 该技术已成为一种新的蛋白质组学和基因组学研究工具， 也是最早通过美国食品与药品管理局 （FDA） 认证的可用于临床诊断的生物芯片技术。
在水产品检疫性病毒检测技术中， 我国检验检疫系统对于水产品病毒所采用的检测技术手段主要包括PCR、RT-PCR等分子生物学检测手段。自PCR技术发明后， 由于其高效性和 高 灵 敏 度， 多 种PCR检 测方法已被应用到水产品病毒的检测中， 但是这些检测技术通常每次只能检测一种病毒， 无法满足快速通关的要求。在对出入境的水产品进行检疫的过程中所应用的检测技术需要达到准确、快速、简便、高通量四项要求， 其中准确最为重要， 因为不准确的检测可能会导致两国的贸易争端；其次是快速， 这对于阻挡重要病原的入侵、蔓延等问题起到了至关重要的作用。当准确和快速均能得到满足时， 省时及便捷的操作步骤则是另一个重要的要求。
1 液相芯片技术原理[5,6,7]
液相芯片体系由许多大小均一的圆形微球 （直径5.5~5.6 μm） 为主要基质构成， 每种微球上固定有不同的探针分子， 将这些微球悬浮于一个液相体系中， 就构成了一个液相芯片系统， 利用这个系统可以对同一个样品中的多种不同分子同时进行检测。
在液相系统中， 为了区分不同的探针， 每一种固定有探针的微球都有一个独特的色彩编号， 或称荧光编码。在微球制造过程中掺入了红色和橙色2种荧光染料 （这2种染料各有10种不同区分） , 从而把微球分为100种不同的颜色， 形成一个具有独特光谱地址的含有100种不同微球的阵列。不同颜色微球在分类激光激发下产生的荧光互不相同， 这种分类荧光是识别不同微球的唯一途径。利用这100种微球， 可以分别标记上100种不同的探针分子。
检测时先后加入样品和报告分子与标记微球反应， 样品中的目的分子 （待检测的抗原或抗体、生物素标记的靶核酸片段、酶等） 能够与探针和报告分子特异性结合， 使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白， 随后利用仪器 （如Luminex100） 对微球进行检测和结果分析。Luminex100采用微流技术使微球快速单列通过检测通道， 并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。红色激光可将微球分类， 从而鉴定各个不同的反应类型 （即定性） ;绿色激光可确定微球上结合荧光分子的数量 （即定量） .因此， 通过红绿双色激光的同时检测， 完成对反应的实时、定性和定量分析。
聚苯乙烯微球根据表面带有的分子残基的不同， 可以结合不同的探针分子， 如带有羧基的微球可同蛋白或核酸结合， 带有Ni-NTA的微球可同带有组氨酸标签的蛋白结合。可以根据需要选择。
2 液相芯片技术的应用
2.1 液相芯片技术在蛋白检测中的应用
表面带有羧基的聚苯乙烯微球 （如Multi Analyte微球和SeroMap微球） , 在EDC和NHS的活化后可以同蛋白分子的氨基形成共价键， 由此可以包被蛋白探针， 检测样本中的目的分子。目前该技术主要应用于细胞因子的检测[8,9,10,11,12,13,14,15], de Jager等[16]使用液相芯片技术检测了经过抗原和丝裂原刺激后外周血单核细胞所分泌的15种细胞因子， 分析结果表明液相芯片技术批内变异小于10%, 批间变异在10%~20%范围， 比传统酶联免疫法 （enzyme linked immune sorbent assay, ELISA） 更敏感和准确。Johannissson等[17]应用液相蛋白芯片方法检测猪促炎症细胞因子 （proinflammatory cytokines） , 灵敏度可达0.18~12 ng/mL.
2.2 液相芯片技术在核酸检测中的应用
带有羧基的微球在MES和EDC的活化后可同核酸探针相连接， 或者使用带有anti-tag标签的微球， 将带有tag的核酸探针与之结合， 样本同微球所携带的探针杂交， 洗脱未结合的DNA, 链亲和素标记的藻红蛋白作为报告荧光。Fulton等[2]使用多通道竞争性杂交分析对HLA等位基因进行分型。他们合成了16个与HLA-DQA1等2个外显子内等位基因序列对应的寡核苷酸作为探针。与探针序列互补的标记寡核苷酸 （竞争性寡核苷酸） 先与未标记的双链模板预杂交， 再与负载了与等位基因互补的探针的微球系统进行杂交， 然后使用Luminex FlowMetrix系统进行荧光分析， 与不加标记竞争物时所获得荧光强度进行比较， 确定出荧光的抑制率。Dunbar等[18]采用PCR技术扩增出待检靶分子DNA后， 通过液相反应， 向靶DNA偶联特异性捕获序列， 再与微球表面的互补寻址探针杂交后进行检测。除此之外， 液相芯片技术还应用于单核苷酸多态性的分析、组织相容性抗原分型、水岸污染中指示菌的监测及病原菌检测等多方面研究。
3 液相芯片技术的优缺点
液相芯片技术最大优点在于高通量， 检测96孔样本只需35~60 min, 对单一样本同时可进行多达100种的不同分析。针对单一分析， 可以一次监测100个数据， 满足统计学要求。对于ELISA而言， 酶标板的一个孔只能包被一种抗原、而液相芯片技术中每种微球有不同的荧光染色， 可以被激光特异性的识别出来， 所以可以将包被不同探针分子的微球混合在一个滤膜板孔中同时进行各种蛋白和核酸的分析[19].
其次在于灵敏度高、特异性强、重复性好， 两束激光可同时分别检测微球分类荧光和报告荧光， 只有与分类荧光同时出现的报告荧光信号才能被检测记录， 信噪比高， 同时只需要极少量样品即可进行检测。对微球表面进行特异性的化学处理， 可进一步提高特异性。再者， 液相芯片的反应是在液相中进行的， 因而反应时间短、操作简便、快捷；同时， 液相的环境给蛋白质的检测提供了一个稳定的环境， 更有利于维持蛋白质的天然构象。
试验证明， 在蛋白分析方面， 液相芯片技术与ELISA相比较， 具有同样的特异性， 并且液相芯片的灵敏度是常规的ELISA方法的灵敏度10~100倍[20].在核酸分析方面， 液相芯片技术与序列测定各有特点， 比逆线印迹 （reverse line blot, RLB） 具有更高的敏感性。
但液相芯片技术有一个比较大的缺点， 就是蛋白分析过程中， 由于部分血清中含有嗜异性抗体， 可与微球或捕获抗体直接连接， 从而形成非特异性的背景值。但这种非特异影响可以通过设定内对照和使用阻断液来消除。
4 液相芯片技术在水产品病毒病检疫中的应用展望
液相芯片技术是一个很灵活的操作平台， 研究者可以根据研究需要增添检测项目， 且检测准确， 信息质量稳定， 可重复性好。液相芯片技术在基础学研究如免疫分析方面运用最为广泛， 此外在临床诊断， 食品卫生监督等均有应用。鉴于在我国进出口水产品检疫中， 经常会对同一样品进行多种疫病的检测， 如果能将液相芯片应用到水产品病毒检疫中， 那么只需很短的时间即可实现同时对多个样品进行多种病毒的高通量检测， 因而有望大大提高口岸检疫性水产病毒的检测效率和灵敏度。
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