摘要
樱桃营养丰富且酸甜可口，16世纪时开始被用于经济栽培，目前已发展为世界性的果树。樱桃具有很好的保健功能，近年来也取得了可观的经济效益。目前樱桃在山东大面积种植，但是随着种植年限的增加，土壤环境逐渐恶化，病虫害频发，不仅影响了樱桃产量和品质，而且使土地质量退化，限制了樱桃果树产业更好的发展。关于樱桃种植年限对土壤微生态环境的影响研究，国内外报道较少。为探讨种植年限对樱桃根际土壤微生态环境的影响，本文研究了山东省烟台市种植5年、10年、15年、20年和25年以及青海省平安县种植5年、10年和15年樱桃根际土壤的理化性质、酶活性、酚酸类物质以及微生物的差异变化，深入地了解樱桃种植年限对根际土壤生物因素和非生物因素产生的影响，旨在找出反映土壤劣化的指标，以期为调控樱桃的种植管理和栽培土壤的健康积累研究资料，提供理论和生产实用依据；本实验还从樱桃根际土壤中筛选了有良好应用潜力的促生细菌，为制作生物菌肥奠定基础。本研究的主要内容和结论如下：
1、不同种植年限樱桃根际土壤理化性质的变化不同。随着种植年限的增加，山东烟台和青海平安的土壤PH无明显变化；土壤碱解氮、速效磷、速效钾和有机质的含量持续增加，其中碱解氮和速效钾含量增长迅速。
2、不同种植年限樱桃根际土壤酶活性的变化不同。随着种植年限的增加，山东烟台的土壤脲酶活性呈不规则的变化趋势，其中25年的土壤脲酶活性最高（2.78mg NH4-N·g-124h-1），与其他年限的土壤形成显着差异；青海平安的土壤脲酶活性高于山东烟台，其活性随着种植年限的增加先上升后下降；山东烟台和青海平安的土壤磷酸酶活性和蔗糖酶活性均随着种植年限的增加而降低，即种植年限越长，酶活性越低；山东烟台的土壤过氧化氢酶活性随着种植年限的增加而增加，其中25年土最高（0.11mol·L-1KMn O4ml·g-1），青海平安的碱性土的过氧化氢酶活性则随着种植年限的增加而下降，但其活性均高于山东烟台。
3、不同种植年限樱桃根际土壤酚酸类物质的变化不同。两地区樱桃根际土壤中苯甲酸、香草醛、肉桂酸的含量均随着樱桃种植年限的增加呈明显的积累，且种植25年和15年的樱桃根际土壤中各酚酸类物质含量明显高于对照土样，分别为苯甲酸0.064μg·Kg-1、0.031μg·Kg-1，香草醛0.050μg·Kg-1、0.025μg·Kg-1，肉桂酸0.031μg·Kg-1、0.012μg·Kg-1。
4、不同种植年限和不同樱桃砧木的根际土壤微生物数量的变化不同。随着樱桃种植年限的增加，土壤中有害真菌的数量增多，而有益真菌、细菌等的数量减少，结果表明种植年限的增加会使土壤微生物的组成比例发生变化，有害微生物增多，影响植物的生长发育；不同樱桃砧木对微生物有不同的聚集作用，比如‘马哈利’的根际土壤有益微生物较多，而‘吉塞拉6号’的有害微生物较多。
5、樱桃根际促生细菌的筛选与鉴定。从樱桃根际土壤中筛选出的三种具有良好应用潜力的细菌，其测序结果于NCBI网站上的Gen Bank核酸数据库进行Blast比对，结果显示，三种细菌分别为微小杆菌Exiguobacterium、蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus和甲基营养芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus。
关键词： 樱桃；根际土壤；土壤酶活性；微生物；种植年限。
Abstract
Cherry is rich in nutrients and sweet and sour. It was used for economic cultivation in the 16th century. Now it has developed into a worldwide fruit tree. Cherry has a goodhealth function and has achieved considerable economic benefits in recent years. At present, cherries are widely planted in Shandong Province, but with the increase ofplanting years, the soil environment deteriorates gradually and pests and diseases occur frequently, which not only affects the yield and quality of cherries, but also deteriorates the quality of land, which limits the better development of cherry industry. There are few reports about the effects of cherry planting years on soil micro-ecological environment at home and abroad. In order to investigate the effects of planting years on the microecological environment of cherry rhizosphere soil, the physical and chemical properties, enzyme activities, phenolic acids and microbial changes of cherry rhizosphere soil in Yantai City, Shandong Province for 5, 10, 15, 20 and 25 years, and Ping'an County, Qinghai Province for 5, 10 and 15 years were studied in this paper. The effects of vegetable and abiotic factors were aimed at finding out the indicators reflecting soil deterioration, in order to provide theoretical and practical basis for regulating cherry planting management and the accumulation of soil health. In addition, growth-promoting bacteria with good application potential were screened from cherry rhizosphere soil in order to lay a foundation for the production of bio-fertilizer. The main contents and conclusions of this study are as follows:
1. The changes of physical and chemical properties of cherry rhizosphere soil are different in different planting years. With the increase of planting years, soil PH in Yantai,Shandong Province and Ping'an, Qinghai Province did not change significantly. Soil alkali-hydrolyzed nitrogen, available phosphorus, available potassium and organic mattercontent continued to increase, among which alkali-hydrolyzed nitrogen and available potassium content increased rapidly.
2. The changes of soil enzyme activity in Cherry rhizosphere were different in different planting years. With the increase of planting years, soil urease activity in Yantai, Shandong Province showed an irregular change trend, among which soil urease activity in 25 years was the highest (2.78mg NH4-N·g-1 24h-1), which was significantly different from that in other years. Soil urease activity in Ping'an, Qinghai Province was higher than that in Yantai, Shandong Province, and its activity increased first and then decreased with the increase of planting years. Soil phosphatase activity and invertase activity decreased with the increase of planting years, that is, the longer the planting years, the lower the enzyme activity. Soil catalase activity increased with the increase of planting years in Yantai, Shandong Province, with the highest activity in 25 years (0.11mol·L-1 KMn O4 ml·g-1), while catalase activity decreased with the increase of planting years in Ping'an alkaline soil in Qinghai Province. But its activity is higher than that of Yantai, Shandong Province.
3、The changes of phenolic acids in Cherry rhizosphere soil were different in different planting years. The contents of benzoic acid, vanillin and cinnamic acid in Cherryrhizosphere soil were significantly increased with the increase of cherry planting years in both acidic and alkaline soils, and the contents of phenolic acids in Cherry rhizosphere soil after 25 and 15 years of continuous cropping were significantly higher than those in non-continuous cropping soils, which were 0.064μg·Kg-1and0.031μg·Kg-1， 0.050μg·Kg-1and 0.025μg·Kg-1, respectively. 0.031μg·Kg-1 and 0.012μg·Kg-1cinnamic acid.
4、The changes of microbial biomass in rhizosphere soil of different cherry rootstocks and planting years were different. With the increase of cherry planting years, the numberof harmful fungi in soil increased, while the number of beneficial fungi and bacteria decreased. The results showed that the increase of planting years would change theproportion of soil microorganisms, increase harmful microorganisms, and affect the growth and development of plants. Different cherry rootstocks had different aggregationeffects on microorganisms, such as in Mahali's rhizosphere soil. There were more beneficial microorganisms and more harmful microorganisms in Gisela 6.
5、Screening and identification of cherry rhizosphere growth-promoting bacteria. Three bacteria with good application potential were screened from cherry rhizosphere soil. Their sequencing results were compared with Blast in Gen Bank nucleic acid database on NCBI website. The results showed that the three bacteria were Exiguobacterium, Bacilluscereus and Bacillus methylotrophicus.
Key words: Cherry; Rhizosphere soil; Soil enzyme activity; Microorganism; Planting years。
1、前言。
樱桃属于蔷薇科落叶乔木果树，其果实含有大量的钙铁等矿物质和维生素，其中铁的含量居众水果之首，医疗保健价值颇高。樱桃原产地在欧洲的东南部和西亚，16世纪时被用于经济种植，现在已经发展成世界果树。樱桃不仅营养丰富，酸甜可口，而且成熟期早，对调节淡季水果市场供应有着积极作用。目前樱桃的经济效益十分可观，为我国的水果产业做出了巨大贡献。近几年，樱桃年消费量逐渐增加，新品种不断增多，但随着种植年限的增加，土壤养分富集，土壤环境逐渐恶化，病虫害频发，不仅影响樱桃的产量和品质，而且使得土壤生产力下降，制约了樱桃果树产业的健康和可持续发展，严重影响了经济效益。
土壤是植物所需水分和矿质营养的基本和主要来源，也是果树栽培的物质基础。果园土壤是构成农业生态系统的一个重要组成部分，同时也具有特殊的生态系统结构体系，更是整个土壤体系的组成部分。土壤是所有植物生长发育的重要物质基础，也是为果树树体提供营养物质的最基础的场所。土壤中的有机质含量、碱解氮含量、速效磷含量、速效钾含量和PH值等理化特性都会直接作用于果树根系的生长发育、养分含量的吸收，最终表现为对果树果实品质的影响。但是理化性状并不能直接反映土壤中生命体的受影响程度和未来趋势，而土壤微生物和土壤酶作为土壤质量和生态系统功能的生物活性指标则可弥补这一缺陷[1]。大量研究表明，土壤生物学特性能敏感地反映土壤质量的变化，是土壤质量评价不可缺少的指标。因此，通过土壤理化性质、土壤微生物多样性、土壤酶活性以及土壤酚酸类物质等土壤指标评价研究土壤微生态系统环境，有利于促进土壤的持续利用。
前人众多研究的结果发现，随着植物种植年限的改变，土壤理化性质、土壤酶活性、酚酸类物质以及土壤微生物的变化情况也不尽相同。吴凤芝等的研究认为种植年限和栽培制度对土壤微生物和酶活性具有重要影响；董艳等的研究也表明随着种植年限的增加，土壤真菌数量持续增加而微生物多样性指数和均匀度指数持续降低[2,3]。
1.1、国内外研究进展。
1.1.1、土壤理化性质研究。
良好的根系环境对植物的健康生长有着重要作用，即根系要有着良好的土壤理化性状。作物对土壤中的养分吸收具有选择性，不同的作物吸收土壤中不同种类、数量和比例的营养元素，尤其是某些微量元素。长期在同一种土壤上种植同种作物，会造成土壤中某些元素的积累或亏缺，从而造成土壤养分分布的不均衡，土壤肥力得不到充分发挥。同时，土壤中的有机质、碱解氮、速效磷和速效钾含量以及PH值等理化特性也会直接作用于植物的根系，从而影响作物的生长发育。
例如紫花苜蓿随着种植年限的增加，土壤中磷元素过量而钾元素消耗过多，土壤养分不平衡[2]；花生长期种植后，土壤养分随着种植年限而发生变化，速效磷和速效钾的含量呈现明显的下降趋势[3]；何琳等的研究发现，烤烟长期种植会导致土壤中速效氮、速效磷、速效钾在表层和中层的土层中的分布不均，比例失去平衡[4]；朱海云等的研究表明随着种植年限的增加，猕猴桃园土壤中有效磷和速效钾的含量逐渐累积而有机质含量逐渐减少，证明了种植年限会对土壤养分造成影响[5]。
1.1.2、土壤酶的研究。
土壤酶主要来源于土壤中的微生物细胞，主要包括脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶等，土壤酶作为土壤的组成成分之一，是由微生物和动植物分泌的具有催化作用的生物活性物质[6]。它不仅可以反应土壤生物的活性，而且可以影响土壤肥力、理化性质和微生态环境等[6,7]。土壤酶参与土壤中各种生化反应，与矿质营养元素的循环、能量转移、有机质分解等密切相关[8]，所以土壤质量的好坏可以通过土壤酶活来反应。
有研究表明，由于脲酶能够把土壤中的有机化合物水解成多种形式的氮，为植物生长发育提供营养成分，因此其活性能够在一定程度上反映土壤的供氮能力；曾宪军等的研究证明土壤过氧化氢酶一定程度上可以影响土壤微生物的氧化还原能力，其活性大小可以表征土壤腐殖质化的强度大小和有机质的转化速度，它能够抵御土壤在化学反应中生成的过氧化氢对植物组织带来的伤害[9]；刘善江等的研究表明土壤蔗糖酶可以提高土壤中的可溶性养分，其活性可以直接影响有机质的转化速度和呼吸强度；而有机磷只有在土壤磷酸酶的催化作用下才能分解转化为可供植物吸收利用的无机磷[10,11]。
1.1.3、土壤微生物的研究。
土壤微生物是土壤中最活跃的部分，主要包括细菌、真菌和放线菌等，它们分布广、数量大、种类多，参与土壤有机质分解、腐殖质合成、养分转化以及土壤的发育和形成，因此研究土壤微生物数量具有重要意义。根际土壤微生物参与根际生态系统的物质转化和循环,微生物群落的组成及其多样性是衡量土壤性质和功能的一个重要指标，土壤微生物种群在经过作物的长期种植后会发生较为明显的变化。主要表现为土壤微生物种群结构、数量以及比例的失衡，土传病害的加重，部分病原菌微生物数量的急剧增加，有益微生物的极大削弱，破坏了原来的根际微生态平衡[12,13]。
胥生荣等的研究发现随着枸杞种植年限的增加，土壤细菌和真菌的数量逐年增加，放线菌数量变化不明显，土壤微生物总量趋于增加，但土壤微生物多样性却逐年降低[14]。周丽霞等在对土壤生物学特性影响土壤健康的研究中指出，土壤微生物的分布结构及其中细菌、真菌和放线菌所占的比例在一定程度上反映了土壤的肥力状况，在性质良好、比较肥沃的土壤中，细菌所占的比率较高而真菌较少[15]。大多数研究认为土壤中的致病真菌、放线菌和腐生菌等毒性微生物是导致专一性再植病害的主要因素[16]。Hoestra H和Sewell GWF研究发现了一种侵扰根系的真菌Thielaviopsis basicota是樱桃专一再植病害的可能原因，樱桃是该真菌的一种有效寄主植物，它对樱桃是致病的[17]。
1.1.4、化感作用的研究。
化感作用(Allelopathy)指的是在植物的生长过程中，通过植物、微生物或者动植物残体分解产生的化学物质，影响该种植物或是其它植物生长发育的化学生态现象。化感作用包括促进和抑制两方面作用，同时也包括对自身的影响[18-20]。
化感作用是通过化感物质来挥发作用的，化感物质分为根系分泌的化感物质和作物残茬腐烂分解产生的化感物质。化感物质对作物一般有两种作用形式，分别是自毒作用和化感作用。一些植物通过地上部淋溶、根系分泌物和植株残茬等途径释放出某些物质对同茬或下茬同种或同科植物的生长产生抑制作用，这种现象被称为自毒作用。目前已在包括黄瓜、苹果、柑橘、西瓜、桃树等许多植物种类上都证实了自毒作用的存在[21-25]。
酚酸类物质是主要的自毒物质[26,27]。植物通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径释放出的酚酸类物质进入土壤中，可以直接影响土壤的养分状况，而且也可能通过改变土壤的微生物活性和病虫害间接地影响植物的生长发育。例如已经有研究发现苹果根系分泌的黄酮根苷（根皮苷）、老桃树根分泌的氰苷在土壤中水解后生成的氢氰酸和苯甲醛，对根系有着毒害作用，并且都会影响各自幼苗的生长发育[28,29]；Yu和Matsui的研究证明，黄瓜根系分泌物中含有多达11种酚酸物质，包括苯甲酸、对轻基苯甲酸、苯丙烯酸等，其中具有生物毒性的有10种[30]；张江红的研究表明，不同果树的根系分泌物有明显不同，樱桃的根系分泌物中肉桂酸是主要的酚类分泌物质，占80%[31]。酚酸类物质能够改变膜的通透性，从而抑制作物对养分的吸收。吴凤芝的研究发现高浓度酚酸会破坏黄瓜的根系细胞核以及贮藏组织结抅，降低根系活力，减弱吸收能力，从而影响黄瓜幼苗的生长发育[32]。Wu F等的研究发现将不同浓度的丁香酸添加到土壤里后，会严重影响黄瓜幼苗的生长情况，而且会引起土壤微生物群落结构改变[33]。可见，根系分泌的酚酸类物质进入土壤后可能影响了土壤中的微生物群落，使土壤中有益微生物减少，有害微生物增加，加重了土传病害的发生，对植物生长发育形成阻碍。
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1.2 植物种植年限对土壤环境的影响
1.2.1 种植年限对土壤理化性质的影响
1.2.2 种植年限对土壤酶活性的影响
1.2.3 种植年限对微生物数量及其组成的影响
1.3 种植年限与连作障碍的关系
1.4 种植障碍的防治措施
1.4.1 筛选抗性品种及砧木
1.4.2 生物防治
1.5 本实验研究的目的与意义
2 材料和方法
2.1 试验材料与处理
2.1.1 供试土壤
2.1.2 樱桃根际促生细菌筛选
2.2 测定方法
2.2.1 土壤理化性质的测定
2.2.2 土壤酶活性的测定
2.2.3 土壤酚酸类物质的测定
2.2.4 土壤微生物的测定
2.2.5 生防菌株的分离、纯化与鉴定
2.2.5.1 生防菌株的分离与纯化
2.2.5.2 生防菌株的筛选
2.2.5.3 细菌鉴定
2.3 数据统计分析
3 结果与分析
3.1 不同种植年限樱桃根际土壤理化性质的变化
3.2 不同种植年限樱桃根际土壤酶活性的变化
3.2.1 脲酶活性变化
3.2.2 磷酸酶活性变化
3.2.3 蔗糖酶活性变化
3.2.4 过氧化氢酶活性变化
3.3 不同种植年限樱桃根际土壤酚酸类物质的变化
3.4 不同种植年限樱桃根际土壤微生物的变化
3.4.1 土壤真菌群落结构
3.4.2 土壤细菌群落结构
3.4.3 土壤放线菌群落结构
3.5 不同樱桃砧木根际土壤微生物的变化
3.5.1 土壤真菌群落结构
3.5.2 土壤细菌群落结构
3.5.3 土壤放线菌群落结构
3.6 樱桃根际促生细菌的筛选
3.6.1 菌种的分离与纯化
3.6.2 目的菌种的鉴定
3.6.2.1 形态特征
3.6.2.2 生理生态特征
3.6.2.3 分子生物学鉴定
4 讨论
4.1 种植年限对楼桃根际土壤理化性状的影响
4.2 种植年限对楼桃根际土壤酶活性的影响
4.3 种植年限对楼桃根际土壤酚酸类物质的影响
4.4 种植年限和砧木类型对樱桃根际土壤微生物数量的影响
4.4.1 种植年限对樱桃根际土壤微生物数量的影响
4.4.2 砧木类型对楼桃根际土壤微生物数量的影响
4.5 樱桃根际促生细菌的作用
5、结论
5.1、随着樱桃种植年限的增加，土壤各养分含量持续增加；虽然各年限土比对照土的PH低，但种植年限的增加对土壤PH没有明显影响。
5.2、随着樱桃种植年限的增加，土壤脲酶活性变化不规则，土壤磷酸酶和蔗糖酶活性逐年下降，酸性土的过氧化氢酶活性逐渐上升，碱性土过氧化氢酶则逐渐下降，碱性土的酶活性普遍高于酸性土。
5.3、随着樱桃种植年限的增加，根际土壤中苯甲酸、香草醛和肉桂酸的含量逐年积累。
5.4、随着樱桃种植年限的增加，部分有害微生物增加而有益微生物减少；在五种樱桃砧木中，‘马哈利’根际土壤中的有益微生物较多而有害微生物较少。
综上所述，樱桃种植年限的增加会引起土壤某些养分富集，土壤酶活性降低，微生物的数量降低种群结构趋于单一，酚酸类物质的含量持续增加，影响樱桃根际土壤环境，使土壤质量恶化；‘马哈利’砧木的根际土壤中微生物总数最多且有害微生物较少，因此选择合适的樱桃砧木可以为樱桃树生长创造良好的微生态环境。
参考文献
