原标题：Avp-iCre转基因小鼠的鉴定
摘要： 将 Avp - iCre 转基因首建小鼠传到 C57BL/6 背景。通过与纯合 R OSA26 Cre 报告小鼠交配来检测iCre（ improved Cre,改进的 Cre 重组酶） 的表达，在子代中研究 β - gal（ beta - galactosidase,β - 半乳糖苷酶）与 AVP（ arginine vasopressin,精氨酸血管加压素） 的共定位关系。利用 ClockLab 软件记录分析 Avp - iCre小鼠跑轮运行行为节律的完整性。实验结果显示 β - gal 和 AVP 在 SCN（ suprachiasmatic nucleus,视交叉上核） 的表达存在明显共定位； Avp - iCre 小鼠具备正常行为节律，其周期为 23. 65 ± 0. 14 h（ Mean ± SD） ,表明该 Avp - iCre 转基因小鼠可用于近日节律研究。
关键词： 近日节律； Cre; 转基因小鼠
近日节律是一种以近似 24 h 为周期的节律，起着调控机体生命活动的作用。这种近日节律由生物体内源性的生物钟所调控。其中哺乳动物下丘脑的 SCN（ suprachiasmatic nucleus,视交叉上核） 是近日节律的中枢振荡器[1].近日节律光系统将光信号通过 R HT（ retinohypothalamic tract,视网膜下丘脑束） 从视网膜传递给 SCN,从而介导光照对生物钟的相位调整[2].SCN 具有异质性，其神经元表达AVP（ arginine vasopressin,精氨酸血管加压素） ,VIP（ vasoactive intestinal polypetide,血管活性肠肽） 和GR P（ gastrin releasing peptide,胃泌素释放肽） 等神经多肽。这些神经元通常处于 SCN 的特定部位，在接受视网膜投射和介导 SCN 钟功能的输出方面也存在差异[1].为了进一步理解这些神经元在 SCN相位调整和功能输出中的作用，单类神经元水平上的操作是必需的。
Cre - LoxP 系统是用来实现组织和细胞特异性基因表达调控的重要实验手段[3],该技术的应用将为研究 SCN 内特定类型神经元在昼夜节律中的功能提供有力的工具。AVP 是 SCN 中 AVP 能神经元表达的神经肽，主要分布在 SCN 的背侧，与 VIP（ 主要分布在 SCN 的腹侧） 的表达部位互补。SCN的 AVP 神经元在昼夜节律中起到重要作用[4].iCre（ improved Cre,改进的 Cre 重组酶） 为 Cre 重组酶的一种优化形式，适用于在哺乳动物系统中使用[5].作者在获取由小鼠 Avp 启动子驱动表达 Cre 转基因小鼠（ Avp - iCre） 的基础上，对该小鼠脑内 iCre 转基因的表达情况以及转基因动物的行为节律进行了鉴定。
1 材料和方法
1. 1 实验所需动物
C57BL /6 WT 小鼠购于武汉大学中南医院动物中心； Avp - iCre 转基因首建小鼠由南京大学徐璎教授赠送，每个基因组含有 2 个 iCre 基因拷贝数。在本实验中，考虑到转基因 Cre 在细胞内的表达量通常较低，因此我们利用 R OSA26 这一 Cre 报道小鼠[6]与 Avp - iCre 转基因小鼠交配，通过对 β - Gal的表达分析间接检测 iCre 重组酶在脑内的表达。
1. 2 转基因小鼠基因型鉴定
按《分子克隆实验指南》制备鼠尾基因组 DNA 作为 PCR 的模板。筛选 Avp - iCre 基因型的引物序列为： AVP - F: GTTCAGCCTTGACTCCAT; AVP - R : ATGTCCAT-CAGGTTCTTCC.筛选 R OSA26 基因型的引物序列为： R OSA - F: AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT; R OSA - R 1:GGAGCGGGAGAAATGGATATG; R OSA - R 2: GCGAAGAGTTTGTCCTCAACC.
1. 3 iCre 重组酶特异性表达
将 Avp - iCre 转基因小鼠与 R OSA26 小鼠交配，在子代中筛选出 Avp - iCre + / - ; R OSA26 + / -双阳小鼠，向第三脑室注射 20 ? g Colchicine 秋水仙素（ 溶于2? L PBS 内） ,24 h 后灌流取脑，冰冻切片，然后进行免疫荧光双标染色。实验中使用的一抗及其生产公司和使用浓度如下： chicken anti - β- Galactosidase（ Abcam,1: 5000） ,rabbit anti - VIP （ Peninsula,1: 10000） ,guinea pig anti - AVP （ Penin-sula,1: 20000） .二抗为组合使用 Alexa / DyLight488 和 DyLight594 标记的二抗（ Jackson Immuno R e-search） ,浓度均为 1: 500.
1. 4 行为记录
自由运行行为记录实验小鼠均饲养于安装有转轮设备的饲养笼中，饲养条件为 DD（ Dark Dark,黑暗的） 环境，动物可自由获取食物和水。跑轮行为记录和分析均通过 ClockLab（ Actimetrix） 软件完成。
2 实验结果
2. 1 转基因小鼠基因型鉴定
Avp - iCre 小鼠通过 BAC 转基因法获得。如图 1 所示，5' - 和 3' - 同源臂将 iCre - IER S - LacZ重组到 AVP locus（ AVP BAC number: R P23 -423） ,该载体主要含有 Avp 启动子元件，iCre 基因序列，内部核糖体结合位点，LacZ 序列，Neo 新霉素抗性基因和 SV40pA 序列等，在 BAC 上替换原有 Avp 基因，并经受精卵的原核注射获得转基因小鼠。
Avp - iCre 首建小鼠为 B6CBF1 背景。将该转基因小鼠回交到 C57BL /6 背景下（ 目前已传至第 5代） .在回交过程中通过 PCR 法从子代中筛选出 Avp - iCre 阳性小鼠。图 2 A 所示为 Avp - iCre 引物 PCR 结果： Avp - iCre 阳性条带大小为676 bp,阴性小鼠则没有大小为676 bp 的条带。实验中我们还将 Avp - iCre 转基因小鼠与 R OSA26 报告基因小鼠进行交配，通过 PCR 法从子代中筛选出 Avp -iCre + / - ; R OSA26 + / - 双阳小鼠，用于后续实验。图 2 B 为 R OSA 三引物 PCR 结果： C57BL /6 WT为单条约 600 bp 的条带； R OSA26 + / + 纯合小鼠为单条约 300 bp 的条带； 而 R OSA26 + / - 杂合小鼠则含两条条带，一条约 600 bp,另一条约 300 bp.
2. 2 iCre 重组酶时空特异性表达
虽然所获取的转基因小鼠含有 LacZ 基因，但前期实验结果表明其表达量较低，难以通过免疫组化方法检测。R OSA26 报告小鼠为常用的 Cre 转基因报告小鼠。因此，为了检测 Avp - iCre 转基因小鼠 iCre 重组酶的时空特异性表达，我们将 Avp - iCre 转基因小鼠与 R OSA26 报告基因小鼠进行交配。
筛选出 Avp - iCre + / - ; R OSA26 + / - 双阳小鼠，灌流取脑并切片，并对脑片进行 β - gal 和 AVP,β- gal 和 VIP 的免疫荧光双标染色分析。染色结果（ 图 3） 显示： β - gal 信号在 SON 和 PVN 区域与AVP 表达几乎完全共定位，在 SCN 区与 AVP 表达也存在着明显的共定位。表明 iCre 基因在转基因小鼠 SCN AVP 神经元内得以表达，并介导 R OSA26 基因座 loxP 位点间的重组，且有效删除了 2 个loxP 之间的片段，从而启动了 LacZ 基因的表达。SCN 区较低程度的共定位可能是因为即使用 Colchi-cine 处理，AVP 在神经元胞体内的表达水平仍然较低。β - gal 和 VIP 免疫荧光双标染色显示，SCN表达 VIP 的细胞，并没有检测 β - gal 信号。上述结果表明 Avp - iCre 转基因小鼠 iCre 重组酶的表达有组织特异性且具有活性。
图 A1,B1,C1 分别显示的是 AVP 在 SCN 区，SON 区，PVN 区的表达情况； 图 A2,B2,C2 分别显示的是 β - gal 在 SCN 区，SON 区，PVN 区的表达情况； 图 A3,B3,C3 分别显示的是 AVP 和 β - gal 在SCN 区，SON 区，PVN 区的共定位表达情况。图 D ~ F 分别显示的是 VIP 和 β - gal 在 SCN 区，SON区，PVN 区的表达情况，其中 VIP 在 SON 和 PVN 区不表达。图 G 和 H 分别为图 A3 和图 D 的放大效果。白色标尺长度表示100 um. 3V: 3rd ventricle,第三脑室； ox: optic chiasm,视交叉； opt: optic tract,视神经束； SCN: suprachiasmatic nucleus,视交叉上核； PVN: paraventricular nucleus,室旁核； SON: supraop-tic nucleus,视上核。
2. 3 行为记录分析
共分析了 9 只 Avp - iCre 转基因小鼠（ 已经回交 4 代） 在全黑环境下的运行节律，利用卡方周期图分析了其自由运行节律周期为 23. 65 ± 0. 14 h（ Mean ± SD） ,与野生型 C57BL/6 小鼠（ 23. 67 ± 0.17h） 相近[7].图 4 列举了一只 Avp - iCre 转基因小鼠在全黑环境下的跑轮行为记录（ 共 30 天的记录结果） ,该小鼠的行为具备正常生物节律。
3 讨论
目前，检测转基因小鼠中 Cre 重组酶表达的方法较多，如 mR AN 水平上的 R T - PCR 和原位杂交等； 蛋白水平上的免疫组织化学染色等。但这些方法都有各自的缺陷，如 mR NA 水平上能检测到 Cre基因是否转录，但不能确定 Cre 蛋白是否翻译； 蛋白水平上，Cre 免疫组织化学染色虽然能检测 Cre 基因的表达部位，但不能确定其是否具有重组酶的活性，且转基因 Cre 在细胞内的表达量通常较低，Cre抗体特异性效果并不是很好。因此通过 R OSA26 报告小鼠间接验证可能是目前最好的一种方法。目前普遍使用的 β - gal 抗体特异性好，使用此方法不仅可以对组织进行免疫组化染色确定其表达部位，而且能证明表达的 Cre 重组酶是否具有活性。本实验利用 Avp - iCre + / - ; R OSA26 + / - 双阳小鼠，采用免疫荧光双标分析 β - Gal 和 AVP 的共定位，发现 β - Gal 和 AVP 有明显的共定位关系，且与 VIP 不存在共定位。这说明，该转基因小鼠中 Avp 启动子特异的启动了 iCre 的表达且具有活性，可用于以后的重组删除研究工作。
考虑到该 Avp - iCre 转基因小鼠主要应用于近日节律研究，所以检测该小鼠的自由运行节律是否正常也是判断该小鼠可使用性的一个标准。结果显示该小鼠具备正常的生物节律。
