棉花黄萎病是一种真菌性病害，广泛分布于世界各产棉国，造成严重的经济损失，其病原菌主要为半知菌亚门轮枝孢属大丽轮枝菌（Verticillium dahlia）。研究大丽轮枝菌的遗传转化对于研究大丽轮枝菌与棉花的互作关系，进而防治棉花大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病具有重要意义。
农杆菌介导的遗传转化法（ATMT）是现在常用于真菌遗传转化的方法，在很多的真菌上都取得了成功的应用。由于农杆菌转化体系是一个天然的转化系统，其具有成功率高，遗传稳定性好的优点，可使外源基因携带不同的启动子在不同组织里特异表达，且其Ti质粒载体可容纳大片段的异源基因，所以成为目前最为常用的真菌转化方法，用于插入突变和基因标记等方面。E. D. Mullins等人成功的将改造好pBHt1载体通过ATMT法转入到黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum中[1],陈强等人利用条件优化该方法将GUS-GFP转入到黄萎病菌中并成功获得了转报告基因（GUS-GFP）的黄萎病菌单胞[2].
另外利用该方法在Cochliobolus heterostrophus 玉米叶枯病菌和 A.nidulans构巢曲霉中高水平的表达了sGFP荧光蛋白报告基因[3],同时在 Pyrenophora tritici-repentis 小麦黄斑叶枯病菌也表达了EYFP,ECFP和 mRFP1这三个荧光蛋白[4].这些报道表明，该方法用于真菌的转化及外源基因的表达是一个十分有效的方法。
目前应用于大丽轮枝菌的遗传转化大多数是采用根瘤农杆菌介导的遗传转化方法，并已经得到了广泛的应用。为了使ATMT法更好地应用于大丽轮枝菌的转化，很多研究将ATMT法进行了相应的优化，研究表明在筛选转化子的过程中，潮霉素浓度为 50 μg/mL ,用于对农杆菌抑制的头孢噻肟钠的最佳浓度为500 μg/mL .研究还发现相比于农杆菌菌株SK1044和EHA105,农杆菌菌株AGL-1和LBA4404更适用于大丽轮枝菌的转化[5].另外，利用ATMT转化方法，将pCTHyg上的T-DNA转入大丽轮枝菌Vd991的基因组中，得到丰富的插入突变体，并对其中30株突变体进行了表型特征和T-DNA插入位点侧翼序列分析[6].KatherineF等人将大丽轮枝菌枯萎病菌中的胰蛋白酶基因VTP1,构建缺失突变体通过ATMT法转化到大丽轮枝菌中，从而在分子水平上分析研究黄萎病病原菌的影响[7].另外最近有研究结果表明，ATMT方法可以有效地被用来鉴别与棉花黄萎病菌中致病性和其他功能相关的基因[8].
至目前，用于在真菌中转录表达基因的启动子主要是trpC、gpdA启动子[9].J. WANG等人将两个过氧化物酶体的信号蛋白PTS1 and PTS2与GFP基因融合，利用来源于稻瘟病菌的MPG1基因作为启动子在稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中转录表达融合基因来研究了过氧化物酶体的生物学作用[10].这表明MPG1基因作为启动子在稻瘟菌遗传转化中转录表达GFP获得成功。本文通过ATMT法将载体pHMG转入大丽轮枝菌中来探讨MPG1基因作为启动子能否在大丽轮枝菌中驱动GFP基因转录表达。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌种和培养基
pHMG载体为浙江省农科院王教喻副研究员赠送，如图1所示，采用trpC启动子驱动潮霉素抗性基因转录表达，采用了一个新的启动子MPG1基因转录表达GFP.大肠杆菌感受态DH5α购自Takara公司，农杆菌AGL-1感受态为本课题组自制，棉花大丽轮枝菌T-9菌株来源于西北农林科技大学杨家荣教授赠送LB培养基用于大肠杆菌培养和农杆菌（10 g/L胰蛋白胨；5 g/L酵母提取物；10 g/L NaCl;固体培养基添加1.5%琼脂粉）；PDA培养基（200 g/L土豆，20 g/L蔗糖；固体培养基添加1.5%的琼脂粉）用于大丽轮枝菌的培养。
1.2 酶与试剂
Taq酶及PCR配套试剂（Takara 公司），引物合成（上海Invitrogen 公司），卡那霉素（Kana）和头孢霉素（Cef）购自于上海生工生物有限公司，潮霉素（Hyg）购自于罗氏公司，GFP一抗和二抗购于浙江杭州华安生物技术有限公司。
1.3 农杆菌介导的遗传转化
ATMT转化大丽轮枝菌的步骤参考陈强等[2]、陈天子等[5]、Mullins等[1]的方案进行农杆菌介导的大丽轮枝菌转化。
具体步骤如下：将棉花大丽轮枝菌菌株T9接种到PDA固体培养基上，25℃，培养7~10 d.活化农杆菌：从LB平板（含50 μg/mL Kana、30 μg/mL Rif）上挑取农杆菌单菌落接种于5mL LB液体培养基（含50 μg/mL Kana、30 μg/mL Rif），220 r/min,28℃过夜培养；5000 r/min离心3 min,弃去上清，用 IM 液体培养基（含 200 μMAS）稀释至OD600=0.1~0.2,诱导培养 4~6 h 至 OD600=0.6;用 3mL IM液体培养基（含200 μMAS）轻轻反复冲洗平板上培养的大丽轮枝菌分生孢子，过滤菌丝后用血球计数板计数，稀释至孢子浓度为 106个/mL.将500 μL已活化的农杆菌AGL-1和500 μL黄萎病孢子稀释液充分混匀后涂布于MM平板（含200 μMAS）的滤纸上，25℃，黑暗倒置培养2d;将 MM（含 200 μMAS）平板上的滤纸转移至PDA筛选固体培养基（含50 μg/mL Hyg和200 μg/mL Cef、400 μg/mL Mox），25℃继续培养 5~7 d.
挑取长势较好的真菌单菌落转化子，至新的PDA筛选固体培养基（含50 μg/mL Hyg和200 μg/mLCef、400 μg/mLMox）上。
挑取转化子菌丝制成样本，置于荧光导致显微镜下观察绿色荧光。
1.4 SDS-CTAB 法提大丽轮枝菌菌基因组及PCR鉴定
大丽轮枝菌培养及基因组提取：挑取已生长约有7 d的转化子，切块培养真菌菌丝，于PDA液体培养基中培养5~7 d后，收集菌体，真空抽干后保存于-80℃备用。用SDS-CTAB法提取基因组，将-80℃下放置的材料称取0.1 g,加入液氮研磨成粉末，加入1.5 mL的EP管中（1/3 V）；迅速加入500 uL 65℃预热的SDS抽提液中，震荡摇匀后放于65℃水浴锅30~45 min.期间每隔10~15 min颠倒一次；加入 100 μL（1/5 V）65℃预热的 5×CTAB抽提缓冲液摇匀后，再置于65℃水浴锅中20 min;冷却后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），颠倒混匀成乳状，室温下12000 r/min离心5 min后取上清。再加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提一次，室温下 12000 r/min 离心 5min后取上清；加入等体积的异丙醇，-20℃静置30 min 后 4℃，12000 r/min 离心 10 min,收集沉淀；沉淀用75%乙醇洗沉淀3~5次，真空干燥5~10 min后放于-20℃备用。
为了确定插入的片段是否整合到大丽轮枝菌基因组中，PCR扩增检测转化子是否为大丽轮枝菌，GFP序列在基因组序列中是否存在。
1.5 酚抽提法提取真菌总蛋白及Western Blot鉴定
1.5.1 酚抽提法提取大丽轮枝菌总蛋白
称取0.25 g存于-80℃的真菌菌丝，加入液氮研磨至粉末，每0.1 g菌体加500 μL真菌蛋白抽提液，冰浴10 min;加入等体积的Tris饱和酚，室温下震荡混匀后，4℃，13000 r/min离心15 min;去上清保留有机酚相层，并加入四倍体积预冷的甲醇，于-20℃至少孵育 6 h;4℃，13000 r/min 离心15 min,获取粗蛋白沉淀；加入等体积预冷的甲醇洗涤粗蛋白沉淀，4℃，13000 r/min离心10 min;去除甲醇，将沉淀真空抽干，得蛋白粉末，溶于适量的ddH2O中，保存于-80℃，备用。
1.5.2 Western Blot鉴定
采用Western Blot检测GFP基因是否在所提大丽轮枝菌总蛋白中是否存在。具体如下。
第一步，转膜：取总蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，95℃恒温金属浴变性5 min,电泳结束后，去蛋白的浓缩胶，保留分离胶并切去其左上角以标记正面，将修建好的蛋白胶放于转膜缓冲液中浸泡15 min,同时准备与胶同等大小的碳酸纤维素膜和滤纸，同样切去左上角进行标记，并将它们放入转膜缓冲液中浸泡 15 min;从下往上依次叠放滤纸三张、碳酸纤维素膜、蛋白胶和滤纸三张，尽量排出气泡后，100 mA恒流转膜1 h;转膜结束后，膜用丽春红染液染色以查看转膜是否成功，若条带清楚且一致说明转膜成功，拍照并记录结果。
第二步，杂交：将膜放入20 mL封闭液（含5%脱脂奶粉的1×TBS）中，于摇床上室温封闭2 h;弃去封闭液，用20 mL 1×TBS于摇床室温洗膜10 min;将膜放入10 mL与1∶5000稀释的一抗混合的封闭液中，于摇床室温孵育 2 h;弃去混合液，用 20 mL 1×TBST溶液于摇床室温洗膜三次，每次10 min,再用20 mL 1×TBS于摇床室温洗膜10 min;将膜放入10 mL 与1∶5000稀释的二抗混合的封闭液中，于摇床室温孵育 1 h;弃去混合液，用 20 mL 1×TBST溶液于摇床室温洗膜三次，每次10 min,再用20 mL 1×TBS于摇床室温洗膜10 min;准备一张保鲜膜，于保鲜膜上加入500 μL ECL Plus Reagent A和500 μL ECL Plus Reagent B,混匀。将膜正面朝下覆盖于混合液上，排出气泡，室温反应5 min,尽量去除多余液体；暗室观察荧光并压片，压片后显影液洗片30 s,定影液洗片30 s,观察结果。
2 结果
2.1 大丽轮枝菌转化子生长情况及荧光观察
将pHMG通过ATMT法转入棉花大丽轮枝菌菌株T-9中，在转移到筛选培养基上长出的转化子如图2,转化率为约80个/106.将pHMG转T-9的转化子#1号置于荧光倒置显微镜下观察菌丝及孢子，结果如图3,观察到该转化子的菌丝及孢子都能发出绿色荧光，表明该pHMG载体已经成功转入大丽轮枝菌T-9菌株中。
2.2 大丽轮枝菌转化子的基因组DNA检测
利用SDS-CTAB改良方法分别提取pHMG转化子的基因组DNA,并且用大丽轮枝菌特异引物鉴定[11]转化子菌株是否为大丽轮枝菌，避免其他真菌的污染，如图2.3电泳结果所示，都能扩增出大丽轮枝菌特异条带，大小为324 bp,表明转化子是大丽轮枝菌。用eGFP片段引物对所提真菌基因组进行PCR鉴定，结果如图4,PCR结果与目的序列大小相符合。检测结果基本证明目的片段序列已转入大丽轮枝菌中。
2.3 大丽轮枝菌转化子的GFP蛋白表达鉴定
利用酚抽提法提取大丽轮枝菌转化子菌株的总蛋白，采用Western Blot检测阳性转化子中插入的GFP基因是否已经表达，结果如图6所示，样品有唯一条带在27KD处，对照无条带。结果表明，GFP基因在大丽轮枝菌转化子中成功地表达了GFP蛋白，与大丽轮枝菌转化子能发出绿色荧光的结果一致。
3 讨论
本研究将pHMG载体成功转入到大丽轮枝菌中，获得了表达绿色荧光蛋白的转化子菌株，表明MPG1基因可作为大丽轮枝菌遗传转化中的新的启动子，也可能能用于其它真菌的遗传转化。MPG1基因是稻瘟病菌的一个表达疏水蛋白的基因，该疏水蛋白参与稻瘟病菌侵染过程中的表面相互作用[12].王教喻等[11]报道MPG1基因作为启动子能在其源菌株稻瘟菌中转录表达GFP基因。相对而言，MPG1基因作为启动子在其源菌株中可能较易成功驱动基因表达，是否能在其它真菌中驱动基因转录表达尚需探索。已有研究表明可用于真菌表达的启动子不多，主要有gpdA启动子和trpC启动子，并且启动子对不同真菌有一定特异性，如trpC、gpdA启动子对Hypholoma sublateritium[9];35S启动子能在真菌平菇中转录表达[13],但我们实验证明35S启动子不能在大丽轮枝菌中转录表达GFP基因（结果未报道）。
因此认为本研究发现MPG1基因可作为大丽轮枝菌遗传转化的新的启动子，并可能能用于其它真菌的遗传转化，具有一定的应用价值。
