摘要：研究通过对《中国知网》收录相关论文的定性与定量分析，梳理并探讨了分子生物技术在我国生药研究领域中的应用历程与发展现状，结果表明：分子生物技术的引入是生药学现代发展的实际需求；分子生物技术在生药研究中已形成稳定的应用领域和研究方向，主要涵盖中药分子鉴定、药用植物分子系统学、药用资源遗传多样性及保护、次生代谢产物的生物合成与调控、道地药材的分子机制研究，以及药用植物的组织培养与育种等7个方面；知识产出具有可持续性，并取得标志性研究成果；独立的知识体系已基本形成，显示出良好的发展潜力。
关键词：生药学； 分子生物技术； 发展态势； 文献研究；
Application of molecular biotechnology in Pharmacognosy
Abstract:Using the methods of informetrics analysis,articles retrieved from the database of CNKI were statistically analyzed on development course and knowledge system,so as to reflect the overall situation of pharmacognostical studies by molecular biotechnology.The result shows that the research on pharmacognosy by molecular biotechnology is an inter-disciplinary research area,the major research fields can be divided into 7 categories,including molecular identification of Chinese medicinal materials,molecular systematics and genetic diversity analysis of Chinese medicinal materials,biosynthesis and bioregulation of secondary metabolites in medicinal plants,molecular mechanism and genetic basis of Dao-di Herbs,and tissue culture and molecular breeding in medicinal plants. The research on pharmacognosy by molecular have achieved remarkable progress in recent 20 years,and have broad development prospects.
Keyword:Pharmacognosy; molecular biotechnology; development situation; literature research;
随着分子生物学研究的不断深入，运用分子生物技术从分子水平研究生药的分类与鉴定、栽培与保护及有效成分生产[1],不但突破了传统生药学研究的思维方式，为解决生药学现代发展的关键问题提供了有效的技术方法支撑，也为生药学的发展带来了全新的模式与研究方向。
文献是科研活动的主要产出形式之一，通过对其内、外部特征的定量与定性分析，能够反映科技知识量的变化，表征科学技术的研究水平与方向。本研究将通过对《中国知网》收录论文的定性与定量分析，梳理和把握分子生物技术在我国生药学领域的应用历程与发展现状，从而为科研人员开展相关工作提供参考依据。
1、方法
1. 1 数据来源
相关数据来源于《中国知网》，以分子生物学、生药学相关术语及主要技术名称为检索词构建检索策略，通过中图分类、关键词、题名和摘要等途径，检索并下载相关科技论文的题录及被引频次等信息，检索日期为2015 年3 月18-20 日。
1. 2 分析方法
1.2.1高被引论文分析
高被引论文在一定程度上反映了学科或领域的研究进展，对于学科或领域发展的影响作用具有重要研究意义。本研究通过按年度筛选每年被引频次排名前1% 的论文，并对论文进行内容分析，同时结合施引文献及相关领域文献反查，以梳理分子生物技术在我国生药领域的应用历程。
1.2.2高频关键词共现聚类
高频关键词有助于反映学科研究的热点。高频关键词共现聚类是通过聚类来观察高频关键词之间的亲疏关系，进而分析这些词所在学科、主题的结构和变化的方法[2].本研究依托TDA,SPSS等分析软件，对2011 年以来相关论文的关键词进行清洗，并由高到低选取频次大于30 的83 个高频关键词，两两统计它们在同一篇论文中出现的次数，形成关键词共现矩阵，通过对矩阵进行聚类分析，以得到分子生药技术在我国生药研究中的主要应用领域。
2、结果与分析
2. 1 分子生物技术在我国生药领域的应用历程
通过对所获得的227 篇高被引论文的分析可以发现，分子生物技术在我国生药研究中的应用主要经历了以下的发展历程与阶段。
20 世纪80 年代末，国内开始有学者将分子生物学的相关技术应用于药用植物的鉴定，以及组织培养与次生代谢研究，例如采用凝胶电泳、RFLP,RAPD等技术进行酸枣仁、银杉等药用植物[3-4],蛤蟆油、鸡内金、蟾酥等动物类中药[5]的鉴定； 以及进行甘草[6]、人参[7]等药物的毛状根培养及次生代谢产物合成研究。
1995 年，黄璐琦[8]在《中国中药杂志》发表论文《展望分子生物技术在生药学中的应用》，认为分子生物技术在生药学中的运用将使生药等的发展进入到一个崭新的发展阶段，并由此产生一门新的学科---分子生药学，首次提出“分子生药学”概念。1995-1999 年，在以中药分子鉴定，以及组织培养与次生代谢产物为重点的基础上，分子生物技术的应用范围开始逐渐有所扩展至药用植物的分子系统学[9-10],濒危药用植物遗传多样性保护[11],以及道地药材的生物学本质探讨[12]的研究。分子鉴定方面，产生发展于20 世纪80 年代的高效毛细管电泳技术，在国内开始报道用于药用植物的鉴定[13-14];内地与香港研究人员合作，采用RAPD与AP-PCR技术，通过获得DNA指纹图谱，进行鉴别了苦地胆等中药和其混淆品[15]; 此外，采用分子生物技术进行海马、海龙类动物药鉴定的研究[16-17]也开始见于报道。在中药组织培养与次生代谢产物研究方面，除了利用发根质粒转化[18],以及通过诱导毛状根产生活性成分[19],有效成分的合成途径与调控研究也开始进行[20].
2000-2005 年，分子生物技术方法的不断发展和引入，生药学研究取得显着进展。首先，国内文献首次报道了AFLP技术，ISSR序列分析在生药研究中的应用，即采用AFLP技术通过分析基因组DNA多态性，构建了人参、西洋参基因组DNA指纹图谱[21],以及通过对7 个不同野生群体的明党参和1个栽培群体的川明参进行ISSR分析，筛选出了川明参一个特有的分子标记[22].其次，2 项研究结果率先登录于Gen Bank,分别为通过完成21 种枫斗类石斛的r DNA ITS区全序列测序，建立了r DNA ITS区碱基全序列数据库[23],以及采用抑制差减杂交技术从4 年生人参根中分离鉴定出6 个可能在人参皂苷生物合成中发挥重要作用的基因[24].在道地药材研究方面，研究人员通过RAPD分析，研究了丹参主要居群的遗传关系及药材的道地性[25]; 并就道地药材形成的生物学基础及模式假说进行了探讨，提出道地药材的道地性越明显，其基因特化越明显[26].
2006 年以来，组学、系统生物学以及DNA条形码技术等为生药学的研究开启了新的篇章。随着理论与技术的不断完善，国内采用DNA条形码技术进行了重楼属[27]、芸香科等药用植物[28],以及白花蛇等动物药的鉴定研究[29].此外，在次生代谢产物研究方面，转录组学，功能基因组、系统生物学的引入，拓展了和延伸了对于次生代谢产物的研究[30-31]; 在植物次生代谢研究为主的情况下，对于海洋真菌次生代谢产物的梳理、探讨也有所开展[32]; 还有研究人员通过分析逆境对中药次生代谢产物积累及道地药材形成的影响，提出了道地药材形成的逆境效应理论[33].在育种方面，遗传图谱的构建，为中药材重要性状的基因定位及遗传育种奠定了基础[34].
2. 2 分子生物技术在我国生药研究中的主要应用领域
高频关键词的共词聚类结果见图1,根据关键词之间的距离，将距离较近的关键词聚集形成概念相对独立的类，使得类内相似性最大，类间相似性最小，通过分析，共形成3 个关键词类，再结合反查、分析各类关键词的文献内容，得到分子生物技术在我国生药研究中的应用领域，主要涉及以下7 个方面。
第一类，以采用DNA分子标记技术、序列分析技术进行中药材鉴别为核心，共涉及3 个领域。
中药分子鉴定： 中药分子鉴定主要包括真伪品鉴定、基源鉴定、亲缘鉴定、种质资源鉴定等。各种DNA分子遗传标记技术、DNA测序技术为通过直接分析遗传物质DNA的多态性来实现中药材的鉴别提供了技术与方法学基础，常用的鉴定技术有RAPD,SSR,RFLP,AFLP,以及最新的DNA条形码技术。此外，对于鉴别药物DNA的抽提及其分析技术的条件体系优化也是分子鉴定研究的内容之一。
药用植物分子系统学研究： 利用DNA分子遗传标记、序列分析技术，从居群、个体及基因水平上，来探讨药用植物的多样性，及其之间演化与系统关系。
药用资源遗传多样性及保护： 利用DNA分子标记、序列分析技术，进行药用植物的种质资源鉴定分类、遗传多样性、起源进化等方面的分析，以了解药用植物的起源、基因分布，为多样性保护，尤其是濒危药物的保护种群确立奠定基础。常用的遗传多样性检测方法包括SRAP,RAPD,AFLP以及ISSR序列分析等。
总体来说，分子鉴定技术是随着分子生物学的发展而发展，常用的方法涉及了以分子杂交为基础和以PCR为基础的分子标记技术，如RFLP,RAPD,ISSR,AFLP等，以及序列分析技术如DNA条形码等。通过对采用相关技术进行研究的论文进行文献量年分布研究，结果见图2.可以发现，RAPD是应用最多，且最早开始应用的技术； 进入2000 年，AFLP,ISSR,SRAP等分子标记技术被引入中药鉴定领域； 2007 年之后，DNA条形码得到了快速发展与广泛应用，目前，已经建立起以ITS2 为核心的植物类药材DNA条形码鉴定体系，并展现出巨大的潜力。此外，RFLP,AFLP等由于技术繁琐，DNA模板质量要求高等原因，应用逐渐减少。
第二类，以有效成分、次生代谢产物研究为核心，主要包括2 个领域。
次生代谢产物的生物合成与调控： 中药材的有效成分多为次生代谢产物，但其在植物中常常含量不高，因此通过培养，以及生物合成来提高次生代谢产物的含量，就成为生药学的重要任务。结合第一部分的应用历程分析可以看到，随着技术的发展，次生代谢产物的研究从组织细胞培养、内生真菌分离研究，到合成途径关键酶基因、调控研究，再到现在各种组学，系统生物学的引进，取得了显着的进展。由于次生代谢产物种类繁多，代谢途径又各不相同，因此对于其生物合成，尤其是合成的途径、技术，以及调控机制一直是研究的热点之一。
道地药材的分子机制研究： 次生代谢产物的产生形成、积累规律研究，对于阐释道地药材有效成分的成因，揭示其道地性和形成机制有着重要意义。次生代谢产物合成可受到多种因素影响，光照、干旱等环境胁迫已被证明是促进植物体内次生代谢产物含量增高，以及道地药材形成的重要因素之一[35].
第三类，以药用植物的组织培养为主，主要涵盖2 个领域。用植物的组织培养与分子育种： 随着植物组织培养技术的成熟和完善，药用植物组织培养、品种优选研究和产业化应用也得到了快速发展。一方面，组织培养可以进行药用植物快速繁殖，利用茎尖、茎段、叶片等外植体进行体外组织培养获得再生植株； 另一方面，运用组织培养技术还可以有助于缩短育种周期，培育新品种，例如以秋水仙素作为诱变剂处理愈伤组织获得多倍体植株，是诱导产生多倍体的好方法[36].此外，应用植物组织和细胞培养是获得次生代谢产物有效途径之一，如通过悬浮培养，或者发根体系，毛状根诱导等[37].
3、讨论与小结
3. 1 分子生物技术的引入是生药学现代发展的实际需求
20 世纪80 年代末，国内开始开展利用分子生物学相关技术进行药用植物鉴定，以及组织培育的研究，分子生物技术为生药学当时面临的如何认识生药的质量变异及其物质基础，生药药效成分积累的生物学机制等一系列科学问题的解决提供了全新的技术和方法[1],在一定程度上将生药学学科的理论和技术引向了深入。
3. 2 分子生物技术在生药研究中已形成稳定的应用领域和研究方向
生药学研究在引入分子生物技术的实践过程中，通过吸收、借鉴，以及不断的发展和完善，逐步形成了稳定的研究领域与方向。分析结果显示，分子生物技术在生药研究中的应用主要覆盖了中药分子鉴定、药用植物分子系统学、药用资源遗传多样性及保护、次生代谢产物的生物合成与调控、道地药材的分子机制研究，以及药用植物的组织培养与育种等七个领域，这七个领域各自有其明确的研究任务，同时又互相联系，各个领域在研究不断深入的同时，又相互促进，共同发展。
3. 3 基于分子生物技术的生药研究已基本形成独立的知识体系，且知识产出可持续
基于分子生物技术的生药研究主要基于遗传学理论基础，面向机制和应用，在分子水平研究生药的遗传背景、开展生药的分子鉴别、揭示次生代谢产物积累的分子机制、探索次生代谢产物的分子调控及生物合成，为中药资源的优质生产和保护提供依据，形成的7 个应用领域具有明确的研究内容，成熟的技术方法，从而构成了独立的知识体系。
3. 4 发展前景广阔，富有前瞻性
分子生物技术与生药学研究的结合，及其在实践中的不断应用和日臻完善，使生药研究进入了一个新的发展阶段，并促生了新的交叉学科---分子生药学的产生，拓展了生药学的研究范围，赋予了生药学新的研究任务。可以预见，随着分子生物技术的不断完善，其对生药学发展的重要推动作用将会得到进一步发挥。
参考文献
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