3种人工核酸酶的原理及其应用探析(2)

　　同年，我们[33]与合作者又利用CRISPR/Cas9技术对食蟹猴基因组进行了修饰，获得多位点基因敲除的双胞胎食蟹猴，这是CRISPR/Cas9技术首次应用于非人灵长类，这对于构建一些由多基因控制的复杂疾病（ 例如帕金森氏病） 的动物模型的研究有非常重要的意义。通过检测新生小猴脐带和胎盘的DNA样本，没有发现脱靶现象。此外，我们利用单细胞测序技术对流产胎儿的生殖系细胞检测后，发现生 殖 细 胞 也 存 在 基 因 突 变，首 次 证 明 了 利 用CRISPR / Cas9技术介导的基因突变可以实现生殖系传递[42].
　　
　　3. 3基因治疗
　　
　　基因治疗是利用基因编辑技术将表达异常的致病基因纠正为正常基因，从而实现治疗疾病的目的。传统的基因治疗难以将细胞中有缺陷的基因精准替换成正常基因片段，而且可能会在细胞中残留其它元件对机体产生很大的毒副作用。而基因编辑新技术则可以精确定位靶基因，在靶位点对基因实施编辑或进行切除，从而达到基因治疗的目的。
　　
　　Li等[43]利用ZFN技术在小鼠体内成功治愈了血友病，该研究首先敲除突变的基因，然后再利用病毒载体将正常的基因导入宿主。传统的基因编辑技术很难实现对线粒体遗传信息的改造，而Bacman等[44]利用TALEN技术成功敲除了线粒体内的突变基因。这是TALEN技术首次应用于线粒体基因的编辑，这项研究有望用于治疗由线粒体DNA突变引起的疾病。
　　
　　CRISPR / cas9系统作为第3代人工核酸酶技术凭借其独特的优势，在基因治疗方面有着更加广泛的应用。 Schwank等[45]利用CRISPR/cas9技术纠正了与囊性纤维化有关的缺陷基因；Hu等[46]利用CRISPR / cas9技术首次成功地把艾滋病病毒从人类细胞中清除，这将极大的推动治愈艾滋病的进程；Yin等[47]利用CRISPR/cas9技术将突变可导致酪氨酸血症Ⅰ型的FAH基因修饰，约成功纠正了部分肝细胞的基因突变，使正常的肝细胞细胞恢复至占肝细胞总量1 /3,这足以治愈该病。
　　
　　4问题与展望
　　
　　人工核酸酶介导的基因编辑技术凭借自身独特的优势，极大的推动了生命科学研究的进程。但是，即使是TALEN、CRISPR/cas9这些能够精确进行基因修饰的人工核酸酶技术也处于发展的初级阶段，研究者需要根据不同的实验需求选择合适的人工核酸酶技术进行基因组修饰。此外，体细胞核移植技术是获得转基因动物最为可靠和有效的方法。在未来的研究中，将人工核酸酶技术与核移植技结合，可以更加高效地建立人类疾病的动物模型，为科学家们深入研究疾病发病机制和探索新的疾病治疗方案提供更多可能。
　　
　　参考文献（References）
　　
　　[1]Plump AS,Smith JD,Hayek T,et al. Severehypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells[J]. Cell,1992,71（2） :343-353
　　[2]Bouvier J,Cheng JG. Recombineering-based procedure forcreating Cre / lox P conditional knockouts in the mouse[J]. CurrProtoc Mol Biol,2009,Chapter 23:Unit 23. 13
　　[3]Smithies O,Gregg RG,Boggs SS,et al. Insertion of DNAsequences into the human chromosomal beta-globin locus byhomologous recombination[J]. Nature,1985,317（6034） :230-234
　　[4]Mansour SL,Thomas KR,Capecchi MR. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells:a generalstrategy for targeting mutations to non-selectable genes[J].Nature,1988,336（6197） :348-352
　　[5]Capecchi MR. The new mouse genetics:altering the genome bygene targeting[J]. Trends Genet,1989,5（3） :70-76
　　[6]Wood AJ,Lo TW,Zeitler B,et al. Targeted genome editingacross species using ZFNs and TALENs[J]. Science,2011,333（6040） :307
　　[7]Lo TW,Pickle CS,Lin S,et al. Precise and heritable genomeediting in evolutionarily diverse nematodes using TALENs andCRISPR / Cas9 to engineer insertions and deletions[J].Genetics,2013,195（2） :331-348
　　[8]Kim YG,Cha J,Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions to Fok I cleavage domain[J]. Proc Natl AcadSci U S A,1996,93（3） :1156-1160
　　[9] 王令，张存芳，张智英。锌指核酸酶在基因组靶向修饰中的应用[J].中国生物化学与分子生物学报（Wang L,Zhang CF,Zhang ZY. Application of zinc finger nucleases in genometargeting modification[J]. Chin J Biochem Mol Biol） ,2009,25（7） :585-589
　　[10]Bitinaite J,Wah DA,Aggarwal AK,et al. Fok I dimerization isrequired for DNA cleavage[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,1998,95（18） :10570-10575
　　[11]Kim S,Lee M J,Kim H,et al. Preassembled zinc-finger arraysfor rapid construction of ZFN[J]. Nat Methods,2011,8（1） :7
　　[12]Beumer KJ,Trautman JK,Bozas A,et al. Efficient genetargeting in Drosophila by direct embryo injection with zinc-fingernucleases[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105（50） :19821-19826
　　[13]Meng X,Noyes MB,Zhu LJ,et al. Targeted gene inactivation inzebrafish using engineered zinc-finger nucleases[J]. NatBiotechnol,2008,26（6） :695-701
　　[14]Zschemisch NH,Glage S,Wedekind D,et al. Zinc-fingernuclease mediated disruption of Rag1 in the LEW / Ztm rat[J].BMC Immunol,2012,13:60
　　[15]Cui X,Ji D,Fisher D A,1mouse embryos with zinc-finger nucleases[J]. Nat Biotechnol,2010,29（1） :64-67
　　[16]Urnov FD,Miller JC,Lee YL,et al. Highly efficient endogenoushuman gene correction using designed zinc-finger nucleases[J].Nature,2005,435（7042） :646-651
　　[17]Moehle E A,Rock J M,Lee YL,et al. Targeted gene additioninto a specified location in the human genome using designed zincfinger nucleases[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104（9） :3055-3060
　　[18]Hockemeyer D,Soldner F,Beard C,et al. Efficient targeting ofexpressed and silent genes in human ESCs and i PSCs using zinc-finger nucleases[J]. Nat Biotechnol,2009,27（9） :851-857
　　[19]Gupta RM,Musunuru K. Expanding the genetic editing tool kit:ZFNs,TALENs,and CRISPR- Cas9[J]. J Clin Invest,2014,124（10） :4154-4161
　　[20]Boch J,Scholze H,Scho Rnack S,et al. Breaking the code ofDNA binding specificity of TAL-type Ⅲ effector[J]. Science,2009,326（5959） :1509-1512
　　[21]Moscou M J,Bogdanove A J. A simple cipher governs DNArecognition by TAL effectors[J]. Science,2009,326（5959） :1501
　　[22] 王昕，张志强，张智英。 TALE核酸酶介导的基因组定点修饰技术[J].中国生物化学与分子生物学报（Wang X,Zhang ZQ,Zhang Z Y. Genome targeting modification technology basedon TALE nucleases engineering[J]. Chin J Biochem Mol Biol） ,2012,28（3） :211-216
　　[23]Kondo T,Sakuma T,Wada H,et al. TALEN-induced geneknock out in Drosophila[J]. Dev Growth Differ,2014,56（1） :86-91
　　[24]Zu Y,Tong X,Wang Z,et al. TALEN-mediated precise genomemodification by homologous recombination in zebrafish[J]. NatMethods,2013,10（4） :329-331
　　[25]Tesson L,Usal C,Ménoret S,et al. Knockout rats generated byembryo microinjection of TALENs[J]. Nat Biotechnol,2011,29（8） :695-696
　　[26]Wefers B,Meyer M,Ortiz O,et al. Direct production of mousedisease models by embryo microinjection of TALEN andoligodeoxynucleotides[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110（10） :3782-3787
　　[27]Hockemeyer D,Wang HY,Kiani S,et al. Genetic engineeringof human pluripotent cells using TALE nucleases[J]. NatBiotechnol,2011,29（8） :731-734
　　[28]Liu H,Chen Y,Niu Y,et al. TALEN-mediate gene mutagenesisin rhesus and cynomolgus monkeys[J]. Cell Stem Cell,2014,14（3） :1-6
　　[29]Hwang WY,Fu Y,Reyon D,et al. Efficient genome editing inzebrafish using a CRISPR -Cas system[J]. Nat Biotechnol,2013,31（3） :227-229
　　[30]Li W,Teng F,Li T,et al. Simultaneous generation andgermline transmission of multiple gene mutations in rat usingCRISPR-Cas systems[J]. Nat Biotechnol,2013,31（8） :684-686
　　[31]Yang H,Wang H,Shivalila CS,et al. One-step generation ofmice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR / Cas-mediated genome engineering[J]. Cell,2013,154（6） :1370-1379
　　[32]Mali P,Yang L,Esvelt KM,et al. RNA-guided human genomeengineering via Cas9[J]. Science,2013,339（6121） :823-826
　　[33]Niu Y,Shen B,Cui Y,et al. Generation of gene-modifidcynomolgus monkey via Cas9 / RNA-mediated gene targeting inone-cell embryos[J]. Cell,2014,156（4） :836-843
　　[34]Wei C,Liu J,Yu Z,et al. TALEN or Cas9-rapid,efficient andspecific choices for genome modifications[J]. J Genet Genomics,2013,40（6） :281-289
　　[35]Gilbert LA,Larson MH,Morsut L,et al. CRISPR-mediatedmodular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J]. Cell,2013,154（2） :442-451
　　[36]Kuscu C,Arslan S,Singh R,et al. Genome-wide analysisreveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9endonuclease[J]. Nat Biotechnol,2014,32（7） :677-683
　　[37]Lin Y,Cradick TJ,Brown MT,et al. CRISPR/Cas9 systems haveoff-target activity with insertions or deletions between target DNAand guide RNA sequences[J]. Nucleic Acids Res,2014,42（11） :7473-7485
　　[38]Geurts AM,Cost GJ,Freyvert Y,et al. Knockout rats via embryomicroinjection of zinc- finger nucleases[J]. Science,2009,325（5939） :433
　　[39]Huang P,Xiao A,Zhou M,et al. Heritable gene targeting inzebrafish using customized TALEN[J]. Nat Biotechnol,2011,29（8） :699-700
　　[40]Wang H,Hu YC,Markoulaki S,et al. TALEN-mediated editing ofthe mouse Y chromosome[J]. Nat Biotechnol,2013,31（6） :530-532
　　[41]Wang H,Yang H,Shivalila CS,et al. One-step generation ofmice carrying mutations in multiple genes by CRISPR / Cas-mediated genome engineering[J]. Cell,2013,153（4） :910-918
        [42]Chen Y,Cui Y,Shen B,et al. Germline acquisition of Cas9 /RNA-mediated gene modifications in monkeys[J]. Cell Res,2015,25（2） :262-265
　　[43]Li H,Viginia H,Yannick D,et al. In vivo genome editingrestores haemostasis in a mouse model of haemophilia[J].Nature,2011,475（7355） :217-221
　　[44]Bacman SR,Williams SL,Pinto M,et al. Specific elimination ofmutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by mitoTALEN[J]. Nat Med,2013,19（9） :1111-1113
　　[45]Schwank G,Koo BK,Sasselli V,et al. Functional repair of CFTRby CRISPR / Cas9 in intestinal stem cell organoids of cysticfibrosis patients[J]. Cell Stem Cell,2013,13（6） :653-658
　　[46]Hu W,Kaminski R,Yang F,et al. RNA-directed gene editingspecifically eradicated latent and prevents new HIV-1 infection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111（31） :11461-11466
　　[47]Yin H,Xue W,Chen S,et al. Genome editing with Cas9 inadult mice corrects a disease mutation and phenotype[J]. NatBiotechnol,2014,32（6） :551-553