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核糖体RNA合成中SUMO化修饰Apak的功能

来源:学术堂 作者:朱老师
发布于:2017-04-12 共5606字
  摘要

        核糖体作为细胞内重要的细胞器负责蛋白质的合成。核糖体包含大小2个亚基,主要由蛋白质和核糖体RNA(r RNA)构成。在哺乳动物细胞中由RNA聚合酶Ⅰ转录47S核糖体RNA前体(pre-r RNA),  47Spre-r RNA合成后发生甲基化、假鸟苷酸化并在特定的位点被切割产生一系列的中间体,最终产生成熟的18S, 28S和5.8S r RNA, RNA聚合酶Ⅱ转录m RNA前体及多数的核内小RNA,  RNA聚合酶Ⅲ转录t RNA,  5S  r RNA等转录产物,其中18S  r RNA参与构成40S核糖体小亚基,而28S, 5.8S和5S r RNA参与构成60S核糖体大亚基[1].
  
  首先核糖体可以响应环境变化和多种应激信号,其次核仁应激可以破坏核仁功能,干扰核核糖体RNA的合成加工并影响核糖体的组装,对细胞增殖有重要影响[2].核糖体RNA的合成加工受多种细胞因子的调节,抑癌蛋白ARF(alterative  reading  frame)对 核 糖 体 的 合 成 有 重 要 调 控 作 用[3],  ARF能 与B23/NPM(B23/nucleophosmin)发生相互作用并诱导其降解从而抑制32S r RNA的剪切[4].另外, ARF与聚合 酶 Ⅰ 的 转 录 终 止 因 子TTF-1(transcriptiontermination  factorⅠ)的核仁定位序列结合影响TTF-1的亚细胞定位导致核糖体的合成抑制[5].  ARF定位于核仁能促进核蛋白的SUMO化修饰[6], SUMO化修饰对底物蛋白的定位、活性和功能有重要调控作用[7],其中ARF介导NPM1(nucleophosmin 1)的SUMO2修饰能抑制28S r RNA的成熟[8].
  
  Apak是KRAB型锌指蛋白家族成员之一,研究发现,  Apak作为p53的负性调控分子,特异地调控p53所介导的细胞凋亡,对细胞周期阻滞没有显着影响[9].在癌基因激活的条件下,  ARF与Apak相互作用,促进Apak与p53解离,激活p53下游凋亡相关靶基因的表达[10].进一步研究发现,  ARF促进Apak移位于核仁,并发生SUMO化修饰;  Apak的SUMO化修饰拮抗其泛素化修饰,稳定Apak的蛋白水平[11].
  
  核仁作为蛋白SUMO化修饰和去SUMO化修饰重要的位置,  SUMO化修饰的Apak在核仁中发挥的作用是否与核糖体RNA的合成有关?本研究将初步探讨SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成的调控作用。
  
  1材料与方法
  
  1.1材料
  
  (1)质粒。   Myc-Ras V12质粒以及Mcy-SUMO-Apak融合表达质粒均由本实验室王珊提供。
  
  (2)  Si RNA.   ARF  Si RNA的序列:  5′-CUCG-UGCUGAUGCUACUGA-3′;非 靶 向 对 照 序 列:  5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′均 由 上 海Gene-Pharm公司合成。
  
  (3)细胞和菌种。   H1299(非小细胞肺癌细胞)以及菌种DH5a均为本实验室保存。
  
  (4)主要试剂。   Northern blot试剂盒购自北京华越洋生物科技公司, TRIzol试剂购自美国Sigma公司,实时定量PCR试剂盒购自日本Toyobo公司,放线菌素D购自美国Sigma公司,转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司,蛋白A/G琼脂糖凝胶珠购自美国Santa Cruz公司,胎牛血清、DMEM 培养基(dulbecco's  modified  eagle  medium)以及胰酶购自美 国Hyclone公 司,质 粒 提 取 试 剂 盒 购 自 美 国Promega公 司,感 受 态 细 胞DH5a购 自 北 京TIANGEN生化科技有限公司, Apak抗体由国家蛋白质中心田春燕制备,  Western  blot显色试剂盒购自美国Pierce公司。
  
  1.2细胞培养及质粒转染
  
  H1299细 胞 培 养 于 含 有10%的 胎 牛 血 清 的DMEM培养液中,置于37℃, 5% CO2培养箱中培养。待细胞生长至70%融合时用美国Invitrogen公司的转染试剂转染,转染量按照说明书规定的量转染。
  
  1.3   Northern blot
  
  实验提取细胞总RNA,制备1%的变性琼脂糖凝胶和样品,上样后50 V电泳约2 h,在紫外灯下观察RNA的完整性,将RNA从变性胶转移至尼龙膜上,电转完将膜在6×柠檬酸盐缓冲液(saline  sodiumcitrate,  SSC)中浸泡5  min,膜放置80℃真空干烤10  min,生物素探针标记(探针序列:  5′-CCCCAAG-GCACGCCTCTCAGATCGCTAGAGAAGGCTTTTC-3′),室温下反应1  h.在预杂交液中预杂交2  h,将变性的探针加入预杂交液杂交3  h,洗膜,在暗室中压片显影。
  
  1.4实时定量PCR
  
  将H1299细胞铺板,外源过表达Mcy-SUMO-Apak质粒,  36  h后收集细胞提取RNA,逆转录后得到c DNA模板。实时定量PCR的反应体系为25  μL,包含水、基因引物、Sybr Green  Mix以及模板,  PCR反应的条件为94℃1 min, 56℃1 min , 72℃1 min,55℃采集荧光信号,每组做3个重复,待反应结束后分析溶解曲线以及扩增效率曲线。引物如下:  18Sr RNA为:  5′-TTTAACGAGGATCCATTGGA-3′和5′-TTACTCGGGAATTCCCTCGT-3′;  5.8S  r RNA为:5′-AAGCGACGCTCAGACAGGCGT-3′和5′-CGACT-CTTAGCGGTGGATCAC-3′;  5S  r RNA为:  5′-ACGG-CCATACCACCCTGAA-3′和5′-GCCAAAGAAAAA-GCCTACAGCA-3′;  t RNASer为:  5′-GCGGAAAGTC-CAGTGATCCA-3′和5′-GGAATCGAACCAGCGAC-CTAAG-3′;  Nucleolin为:  5′-TTGCGACGCGTACGA-GCTGG-3′,和5′-ACTCCGACTAGGGCCGATAC-3′;  GAPDH为:  5′-GTATTCCCCCAGGTTTACATG-3′和5′-TTCTGTCTTCCACTCACTCC-3′。
  
  1.5   RNA-Ch IP
  
  将H1299细胞培养至90%融合时,加入终浓度为1%的甲醛室温放置10  min后加甘氨酸终止固定,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)漂洗后将细胞裂解、超声破碎离心取上清。上清中加入蛋白A/G琼脂糖凝胶珠清除非特异蛋白,留取10 μL作为input(样品裂解液上清,未加Apak抗体)备用,在预清除的上清中加入Apak抗体过夜后再加蛋白A/G琼脂糖凝胶珠放摇床2  h,凝胶珠洗涤后将蛋白质和RNA复合物洗脱, RNA去交联纯化后用于PCR检测。
  
  1.6   Western blot
  
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