核糖体作为细胞内重要的细胞器负责蛋白质的合成。核糖体包含大小2个亚基，主要由蛋白质和核糖体RNA（r RNA）构成。在哺乳动物细胞中由RNA聚合酶Ⅰ转录47S核糖体RNA前体（pre-r RNA）， 47Spre-r RNA合成后发生甲基化、假鸟苷酸化并在特定的位点被切割产生一系列的中间体，最终产生成熟的18S, 28S和5.8S r RNA, RNA聚合酶Ⅱ转录m RNA前体及多数的核内小RNA, RNA聚合酶Ⅲ转录t RNA, 5S r RNA等转录产物，其中18S r RNA参与构成40S核糖体小亚基，而28S, 5.8S和5S r RNA参与构成60S核糖体大亚基[1].
首先核糖体可以响应环境变化和多种应激信号，其次核仁应激可以破坏核仁功能，干扰核核糖体RNA的合成加工并影响核糖体的组装，对细胞增殖有重要影响[2].核糖体RNA的合成加工受多种细胞因子的调节，抑癌蛋白ARF（alterative reading frame）对 核 糖 体 的 合 成 有 重 要 调 控 作 用[3], ARF能 与B23/NPM（B23/nucleophosmin）发生相互作用并诱导其降解从而抑制32S r RNA的剪切[4].另外， ARF与聚合 酶 Ⅰ 的 转 录 终 止 因 子TTF-1（transcriptiontermination factorⅠ）的核仁定位序列结合影响TTF-1的亚细胞定位导致核糖体的合成抑制[5]. ARF定位于核仁能促进核蛋白的SUMO化修饰[6], SUMO化修饰对底物蛋白的定位、活性和功能有重要调控作用[7],其中ARF介导NPM1（nucleophosmin 1）的SUMO2修饰能抑制28S r RNA的成熟[8].
Apak是KRAB型锌指蛋白家族成员之一，研究发现， Apak作为p53的负性调控分子，特异地调控p53所介导的细胞凋亡，对细胞周期阻滞没有显着影响[9].在癌基因激活的条件下， ARF与Apak相互作用，促进Apak与p53解离，激活p53下游凋亡相关靶基因的表达[10].进一步研究发现， ARF促进Apak移位于核仁，并发生SUMO化修饰； Apak的SUMO化修饰拮抗其泛素化修饰，稳定Apak的蛋白水平[11].
核仁作为蛋白SUMO化修饰和去SUMO化修饰重要的位置， SUMO化修饰的Apak在核仁中发挥的作用是否与核糖体RNA的合成有关？本研究将初步探讨SUMO化修饰的Apak对核糖体RNA合成的调控作用。
1材料与方法
1.1材料
（1）质粒。 Myc-Ras V12质粒以及Mcy-SUMO-Apak融合表达质粒均由本实验室王珊提供。
（2） Si RNA. ARF Si RNA的序列： 5′-CUCG-UGCUGAUGCUACUGA-3′；非 靶 向 对 照 序 列： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′均 由 上 海Gene-Pharm公司合成。
（3）细胞和菌种。 H1299（非小细胞肺癌细胞）以及菌种DH5a均为本实验室保存。
（4）主要试剂。 Northern blot试剂盒购自北京华越洋生物科技公司， TRIzol试剂购自美国Sigma公司，实时定量PCR试剂盒购自日本Toyobo公司，放线菌素D购自美国Sigma公司，转染试剂Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司，蛋白A/G琼脂糖凝胶珠购自美国Santa Cruz公司，胎牛血清、DMEM 培养基（dulbecco's modified eagle medium）以及胰酶购自美 国Hyclone公 司，质 粒 提 取 试 剂 盒 购 自 美 国Promega公 司，感 受 态 细 胞DH5a购 自 北 京TIANGEN生化科技有限公司， Apak抗体由国家蛋白质中心田春燕制备， Western blot显色试剂盒购自美国Pierce公司。
1.2细胞培养及质粒转染
H1299细 胞 培 养 于 含 有10%的 胎 牛 血 清 的DMEM培养液中，置于37℃， 5% CO2培养箱中培养。待细胞生长至70%融合时用美国Invitrogen公司的转染试剂转染，转染量按照说明书规定的量转染。
1.3 Northern blot
实验提取细胞总RNA,制备1%的变性琼脂糖凝胶和样品，上样后50 V电泳约2 h,在紫外灯下观察RNA的完整性，将RNA从变性胶转移至尼龙膜上，电转完将膜在6×柠檬酸盐缓冲液（saline sodiumcitrate, SSC）中浸泡5 min,膜放置80℃真空干烤10 min,生物素探针标记（探针序列： 5′-CCCCAAG-GCACGCCTCTCAGATCGCTAGAGAAGGCTTTTC-3′），室温下反应1 h.在预杂交液中预杂交2 h,将变性的探针加入预杂交液杂交3 h,洗膜，在暗室中压片显影。
1.4实时定量PCR
将H1299细胞铺板，外源过表达Mcy-SUMO-Apak质粒， 36 h后收集细胞提取RNA,逆转录后得到c DNA模板。实时定量PCR的反应体系为25 μL,包含水、基因引物、Sybr Green Mix以及模板， PCR反应的条件为94℃1 min, 56℃1 min , 72℃1 min,55℃采集荧光信号，每组做3个重复，待反应结束后分析溶解曲线以及扩增效率曲线。引物如下： 18Sr RNA为： 5′-TTTAACGAGGATCCATTGGA-3′和5′-TTACTCGGGAATTCCCTCGT-3′； 5.8S r RNA为：5′-AAGCGACGCTCAGACAGGCGT-3′和5′-CGACT-CTTAGCGGTGGATCAC-3′； 5S r RNA为： 5′-ACGG-CCATACCACCCTGAA-3′和5′-GCCAAAGAAAAA-GCCTACAGCA-3′； t RNASer为： 5′-GCGGAAAGTC-CAGTGATCCA-3′和5′-GGAATCGAACCAGCGAC-CTAAG-3′； Nucleolin为： 5′-TTGCGACGCGTACGA-GCTGG-3′，和5′-ACTCCGACTAGGGCCGATAC-3′； GAPDH为： 5′-GTATTCCCCCAGGTTTACATG-3′和5′-TTCTGTCTTCCACTCACTCC-3′。
1.5 RNA-Ch IP
将H1299细胞培养至90%融合时，加入终浓度为1%的甲醛室温放置10 min后加甘氨酸终止固定，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline, PBS）漂洗后将细胞裂解、超声破碎离心取上清。上清中加入蛋白A/G琼脂糖凝胶珠清除非特异蛋白，留取10 μL作为input（样品裂解液上清，未加Apak抗体）备用，在预清除的上清中加入Apak抗体过夜后再加蛋白A/G琼脂糖凝胶珠放摇床2 h,凝胶珠洗涤后将蛋白质和RNA复合物洗脱， RNA去交联纯化后用于PCR检测。
1.6 Western blot
