摘 要： 应用固相微萃取-气质联用技术（solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,SPME/GCMS）对桑葚的挥发性风味物质分析。结果发现：萃取头为50/30μm DVB/CAR/PDMS，饱和时间30 min，萃取60 min效果最好；在此条件下共鉴定出28种挥发性化合物，包括醛类8种，芳香族化合物6种，酯类6种，醇类4种和酸类4种。同时，对已鉴定出的风味化合物进行定量分析，并结合挥发性物质的气味活度值确定桑葚的香气活性物质，结果包括醛类6种，酯类4种，有机酸类3种，芳香族2种和醇类2种被确定为桑葚的气味活性物质，而异辛醇、糠醛、苯甲醛和己酸的气味活度值（odor activity value,OAV）小于1，对桑葚风味贡献度较小。
关键词： 桑葚; 固相微萃取; 气质联用; 挥发性化合物; 气味活度值;
Abstract： The determination method of mulberry volatile matter by solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry(SPME/GC-MS)was optimized and the compositions and characteristics of the volatile matter were identified. The results showed that the extraction head was 50/30 μm DVB/CAR/PDMS,the saturation time was 30 min,and the extraction time was 60 min. A total of 28 volatile compounds,including8 types of aldehydes,6 types of aromatic compounds,6 types of esters,4 types of alcohols and 4 types of acids,were identified under the above conditions. At the same time, the identified flavor compounds were quantitatively analyzed,and the aroma active substances of mulberries were determined based on the odor activity value of volatile substances,ncluding 6 types of aldehydes,4 types of esters,3 types of organic acids,2 types of aromatic compounds and 2 types of alcohols were identified as the odor active substances of mulberries,while odoractivity value(OAV)< 1 of isooctyl alcohol,furfural,benzaldehyde and caproic acid contributed less to the flavor of mulberry.
Keyword： mulberry; solid phase micro-extraction; gas chromatography-mass spectrometry; volatile compounds; odor activity value;
桑葚，是桑科桑属多年生木本植物桑树的果实，椭圆形，长1 cm～3 cm，表面不平滑。桑葚中不仅含有丰富的蛋白质、维生素A原、氨基酸、矿物质钙等营养成分[1]，而且含有多种功能性成分，具有良好的防癌、抗衰老、抗病毒等作用。Kim SY等[2]研究发现，服用桑叶茶具有降低血糖的功效。此外，桑葚红色素是极好的天然花青类色素，具有很高的着色性以及稳定性，对人体无害[3,4]。目前大多数科研学者对于桑葚的研究主要集中在桑葚的营养成分、药理作用以及花青素等，对风味的研究非常少。由于桑葚营养价值高，具有很高的食用、药用价值，目前许多加工工厂也开发一些桑葚制品，并且相关产品以其独特的风味深受广大消费者的喜爱。
本文利用气质联用技术分析了桑葚挥发性风味物质的组成并确定了其香味活性物质，为深入了解桑葚及其相关产品的风味构成特点，拓展相关产品的品种提供理论参考。
1、 材料与方法
1.1 、材料与试剂
无沙黑桑葚干：产自新疆吐鲁番。
气相色谱标准品烷烃（C4-C20）：美国Sigma公司；2-甲基丁醛、正戊醛、异戊醛、正庚醛、正癸醛、正壬醛、糠醛、1-辛烯-3-醇、异戊醇、异辛醇、异戊酸、2,3-丁二醇、乙酸、2-甲基丁酸、己酸、苯甲醛、苯乙醛、苯乙酮、苯甲酸甲酯、2-苯乙醇、3-羟基2-丁酮、乙酸乙酯、乙酸戊酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯、己酸甲酯、己酸乙酯等标准化合物：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷（分析纯）：大连博诺公司。
1.2、 仪器与设备
MPS2固相微萃取自动进样器：德国Gerstel公司；DVB-CAR-PDMS（涂层厚度50/30、65、75、100μm）萃取头：美国Supelco公司；Agilent 6890/5975C气质联用仪：安捷伦科技有限公司；FA1004型分析天平：上海精天科贸有限公司；SZF-06A索氏提取器：上海新嘉电子有限公司；2010+Plus岛津气相色谱：岛津集团有限公司。
1.3、 方法
1.3.1、 固相微萃取（solid-phase microextraction,SPME）预处理
精确称取3.0 g经液氮冷冻后磨成粉末的桑葚粉于20 mL顶空进样瓶中，加入1 mL 20%的NaCl，使其与桑葚粉末混合均匀，并用硅橡胶垫密封，在40℃恒温水浴锅中平衡30 min，使用4种不同固相微萃取纤维头（50/30μm DVB/CAR/PDMS,65μm PDMS/DVB,75μm CAR/PDMS and 100μm PDMS）采样吸附，来优化评估。同时对不同饱和时间（15、30、45 min）和萃取时间（30、45、60、75 min）进行优化，每个试验重复3次平行，确定优化条件。
1.3.2 、挥发性物质的检测分析
1）色谱条件：Agilent 6890/5975C气质联用仪，HP-5MS(30 m×0.25 mm i.d.,0.25μm）色谱柱；氦气为载气，不分流模式，流速：1 mL/min；程序升温：初始温度40℃，保留5 min，以3℃/min的速率升至50℃，保留3 min，再以5℃/min的速率升至150℃，最后以20℃/min升至250℃，保留5 min。进样口温度250℃；检测器250℃；MSD温度250℃。EI电离源，电子能量70 ev；离子源温度230℃；扫描范围29 amu～400 amu。四极杆温度150℃[5]。
2）对质谱图用计算机Nist 08谱库检索，结合软件进行人工解析、色谱保留指数和标准化合物比对鉴定。
1.3.3、 桑葚挥发性风味物质定量分析
1.3.3. 1 、标准溶液的配制
准确称取1.1中的标准品配制于二氯甲烷中，每毫升二氯甲烷中含有1μL标品，混合均匀。
1.3.3. 2、 样品预处理
精确称取3 g桑葚粉末，用滤纸包好放置于索氏提取器中，在圆底烧瓶中加入二氯甲烷，60℃水浴回流提取10 h，提取液50℃水浴蒸出有机溶剂，剩余部分氮吹浓缩至1 mL，将浓缩液密封保存待进入气相色谱进行定量分析用[6]。
1.3.3. 3、 桑葚挥发性嗅感物质定量检测
1）色谱条件：岛津2010气相色谱仪，ATX-5(30 m×0.25 mm i.d.,0.25μm）色谱柱；载气为高纯氮气，流速1 mL/min，氢离子化火焰检测器，手动进样方式。
2）化合物浓度（μg/g）=该化合物所对应的标准品浓度×该化合物峰面积/该化合物所对应的标准品峰面积
1.3.3. 4 、气味活度值
气味活度值（oder activity value,OAV）=挥发性风味物质的浓度/香气阈值
2 、结果与分析
2.1 、固相微萃取条件的优化
2.1.1 、萃取头类型对萃取效果的影响
用不同类型萃取头对桑葚挥发性风味物质进行分析检测，挥发性成分的总离子流色谱图如图1所示。
图1 4种不同萃取头测定桑葚挥发性风味物质总离子流图
Fig.1 Total ion current chromatograms in the analysis of four different fibers
由图1可知，PDMS/DVB、CAR/PDMS和DVB/CAR/PDMS 3种萃取头出峰的数目要比PDMS多，CAR/PDMS萃取头在后阶段中检出的风味物质较少，而萃取头DVB/PDMS检测出的大多数化合物的峰面积相对于DVB/CAR/PDMS萃取头较小。同时，这种萃取头萃取出的挥发性物质更多，范围更大，峰强度更高，更适于成分复杂的挥发物的鉴定，吸附灵敏度更高[7]。因此，选择50/30μm DVB/CAR/PDMS为本试验的最佳萃取头类型。
2.1.2、 饱和时间对萃取效果的影响
不同饱和时间对嗅感物质的萃取效果如图2。
图2 不同饱和时间对嗅感物质萃取效果的影响
Fig.2 Effects of different saturation time on extraction efficiency of olfactory substances
由图2可知，饱和时间对桑葚中挥发性化合物的影响较大，大部分风味物质的峰面积随时间的增加而增加。其中，除苯乙烯、丙二醇甲醚醋酸酯和丁酸丁酯外其他物质的峰面积均随着饱和时间的升高而增大。因此，综合考虑不同挥发性物质在不同时间的峰面积及稳定性变化，选择饱和时间30 min作为最优条件。
2.1.3 、萃取时间对萃取效果的影响
不同萃取时间对桑葚挥发性风味物质的萃取效果如图3。
从图3可知，部分风味物质随萃取时间的增加呈现先增加后减少的趋势，但总体上在萃取时间为60min时绝大部分挥发性物质的峰面积达到最大值，在75 min时其峰面积略有降低[8]，表明较长的萃取时间不一定得到最好的萃取效果[9,10]。另外，部分化合物的峰面积随萃取时间的延长变化不明显。研究发现：挥发性组分的分配系数、物质的扩散速率、样品体积等因素决定了萃取过程的变化[11]。在此试验中萃取时间为60 min时，萃取效果最佳，故选择60 min为最佳萃取时间。
综上，固相微萃取的最优的试验方案为：使用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头在40℃下饱和30 min，萃取60 min。
图3 不同萃取时间测定桑葚挥发性风味物质萃取效果图
Fig.3 Effect of mulberry volatile flavor compounds extraction efficiency by different extraction time
2.2、 桑葚挥发性风味物质定性分析结果
利用优化好的条件，分析桑葚挥发性风味物质其气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectromety,GC-MS）总离子流图如图4，经分析鉴定所得到的桑葚挥发性风味物质见表1。
图4 桑葚挥发性风味物质GC-MS总离子流图
Fig.4 Total ion current chromatogram in the analysis of volatile of mulberry by GC-MS
表1 桑葚挥发性风味物质定性分析结果表
表1 桑葚挥发性风味物质定性分析结果表
由表1可知，醛类化合物是构成桑葚挥发性化合物的主要物质，在桑葚挥发性风味物质具有重要作用。研究发现：多不饱和脂肪酸氧化形成醛类物质，醛类对食品风味贡献很大，是风味重要来源[12]，其中2-甲基丁醛具有浓郁的麦香。研究发现具有青草味的己醛来自脂质的氧化和微生物的氨基酸的分解代谢[13,14]。魏好程等[15]研究发现具有杏仁味的苯甲醛也是桃果实的主要呈香物质之一。
芳香族化合物和酯类物质检测出的数量较醛类物质少，但也对桑葚的风味有重要贡献，是仅次于醛类物质的挥发性化合物。在桑葚中共检测出6种芳香族化合物。其中苯甲醛具有杏仁和甜的味道，它是由苯丙氨酸经斯特雷克降解形成的[16]。酯类物质也有6种。
检测出4种醇类物质，醇类物质是脂肪酸氧化的产物[17]，一般醇类挥发物具有较高的阈值，其中戊醇具有花香和树脂的味道，而亚油酸降解产物1-辛烯-3-醇具有蘑菇、蔬菜的气味[18]，是桑葚挥发性风味物质构成中较为重要的一种醇类物质。
此外，还检测到4种酸类物质，而有机酸为水果中必不可少的成分之一，并对桑葚的风味具有重要贡献[19]。
2.3、 桑葚风味化合物定量及香气活性物质的确定结果
2.3.1 、定量分析结果
通过对桑葚中28种挥发性嗅感物质进行定量分析，结果见表2。
表2 桑葚挥发性风味物质定量分析及气味活度值（OAV)
注：-代表未检出。
由表2可知，在桑葚中丁酸乙酯的含量最高（263 056.30μg/g），其次是正己醛（178 872.50μg/g）和乙酸（86 142.69μg/g）。而己酸乙酯和异辛醇在的含量最小，分别为131.10μg/g和133.41μg/g。从挥发性化合物的总含量来看，酯类化合物是桑葚制品中最主要的嗅感物质，己酸乙酯和己酸甲酯相对较低，但也分别达到了131.10μg/g和1 052.65μg/g。在所有醛类物质中，正己醛（178 872.50μg/g）是含量最高的嗅感物质，据报道它是由脂类的β氧化产生的[20]，其次是正庚醛（2 985.32μg/g）。芳香族化合物中苯甲酸甲酯含量最高，有机酸类乙酸含量最高，醇类含量相对偏低，含量最高的是292.86μg/g的1-辛烯-3-醇。
2.3.2 、香味活性物质分析结果
从表2中可知，桑葚制品中有17种挥发性风味物质的气味活度值（OAV）大于其本身化合物的阈值，即OAV≥1，包括醛类6种，酯类4种，酸类3种，芳香族2种和醇类2种，在所有嗅感物质中异戊醛的气味活度值最高（10588008）。因此，这17种挥发性化合物被确定为桑葚中的香味活性物质，而异辛醇、糠醛、苯甲醛、己酸的OAV均小于1，说明其对桑葚的风味贡献较小。
上述结果表明，醛类和酯类化合物对桑葚制品的风味有较大贡献，在桑葚风味中起主要作用，OAV值相对来说也比较高，研究发现醛类和酯类化合物也是其他品种水果中主要的风味物质，对水果的香气贡献较大。
3 、结论
本文优化了固相微萃取-气质联用技术对桑葚挥发性物质的测定方法，并分析鉴定了其挥发性风味物质的构成及特点。结果发现：萃取类型为50/30μm DVB/CAR/PDMS，饱和时间30 min，萃取时间60 min为最佳分析条件；在此条件下共分析鉴定出28种挥发性化合物，包括醛类8种，芳香族化合物6种，酯类6种，醇类4种和酸类4种；其中17种挥发物被确认为桑葚的香气活性物质，而异辛醇、糠醛、苯甲醛和己酸的OAV<1，对桑葚风味贡献度较小。
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