结蛋白（desmin）基因位于人类染色体2q35[1],编码的结蛋白分子量为52 000. 结蛋白作为一种细胞骨架蛋白，是Ⅲ型中间纤维的重要成员之一[2-3],主要存在于肌细胞中,如平滑肌、骨骼肌、心肌[4-6]以及神经肌肉接头处，如突触后膜、肌腱接点和肌纤维膜附着点[7-8].
结蛋白除在细胞内起到机械性的支撑作用外,还与信号转导、心肌细胞收缩、再生、线粒体功能调节等功能有关[9-10].结蛋白参与多种心脏相关疾病,例如结蛋白基因突变可以导致扩张型心肌病、结蛋白相关心肌病等[11-13];过表达突变型的结蛋白可造成肌浆膜内异常结蛋白积聚、排列紊乱，使心肌肥厚、功能受损，导致充血性心力衰竭;结蛋白表达异常出现于不同原因导致的心力衰竭过程中[14-15].
在利用基因敲除小鼠进行的研究中发现，结蛋白基因敲除小鼠在胚胎发育期没有明显异常表型,但是小鼠出生后发生骨骼肌、心肌和平滑肌功能障碍[10],组织学分析显示肌结构严重破坏和退化,平滑肌发育不全和退化,心肌细胞进行性退化和坏死[16].其他研究也证实,结蛋白是骨骼肌和心肌发育过程中重要的标志和功能蛋白[11,17].
但是,结蛋白是否仅在出生后影响肌肉组织的发育,在胚胎早期发育中是否也发挥作用，目前尚未阐明。本文利用非洲爪蛙作为模式动物,研究结蛋白对早期胚胎发育中的作用.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素（human chorionic go-nadotropin,hCG,Sigma 公司 ,美国 ），DNaseⅠ、 限制性核酸内切酶、T7聚合酶、T4连接酶和RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit （Thermo Fermentas 公司,美国），RNA纯化试剂盒RNeasy Mini Kit（QIA-GEN 公司， 德国），Dig-UTP、anti-Dig-AP、BM Purple（Roche公司,瑞士），RNA合成试剂SP6 mMessageTMKit（Ambion 公司，美国），Taq DNA 聚合酶、PrimeS-TAR@HS DNA 聚合酶 、SYBR@Premix Ex TaqTM定量PCR 试剂盒（TaKaRa 公司，日本）。
1.1.2 引物和反义吗啉代寡核苷酸结 蛋 白 克 隆 引 物 序 列 为: 上 游 引 物 :5′ -CCGGGAATTCCAACCATGAGCCAGTCCTAC -3′ ;下游引物：5′-AATTGGTCCGCTTCCTGTGTAG-3′，定量PCR 引物为：上游引物：5′-GGCACGTGTGGAGGTA-GAAA-3′， 下游引物：5′-GCGTCTCTCCAGGTCTAT-GC-3′，其他定量 PCR 引物参见文献[18].
根据结蛋白基因5′端序列 设计特异性封闭结蛋白的反义吗啉代寡核苷酸（morpholino oligonu-cleotide,MO）， 命 名 为 desmin MO, 序 列 为 :5′ -GGTTGCTTGAATAGGATGGCTCAT-3′，由美国 GeneTools 公司合成。
1.2 方法
1.2.1 质粒构建根据结蛋白基因序列 （GenBank Accession No:BC077922.1）设计克 隆 PCR 引物 ,通过 RT-PCR 对结蛋白的编码区进行扩增,双酶切PCR 产物并将其连接至pCS2+质粒上，命名为 pCS2+-desmin.
1.2.2 胚胎操作及显微注射试验前12 h 左右注射 300~600 U hCG 诱导雌性爪蛙排卵。体外受精 30 min 后，去除受精卵外的胶质膜,在0.1×MBSH[1×MBSH:88 mmol / L NaCl、2.4 mmol / L Na2CO3、1 mmol / L KCl、0.82 mmol / LMgSO4、0.41 mmol / L CaCl2、0.33 mmol / L Ca （NO3）2,10 mmol / L HEPES,pH7.4]中培养至相应发育阶段。 胚胎发育阶段的划分依照Nieuwkoop 和 Faber 分期[19].将50 ng desmin MO 在胚胎 4 细胞期时注射入 4个细胞中,以实现对结蛋白的敲降,将胚胎置于恒温培养箱中进行培养,用于表型观察及基因表达分析.
1.2.3 逆转录和实时定量 PCR收集胚胎并提取RNA, 以 DNaseⅠ消化并 用RNeasy Mini kit 纯化 . 取 1 μg 各胚胎总 RNA 用RevertAidTMfirst strand cDNA synthesis kit 逆转录为cDNA. 以逆转录的 cDNA 为模板，采用 TaKaRa 的SYBR Green 试剂盒进行实时定量 PCR.
1.2.4 整胚原位杂交将pCS2 +-desmin 用 EcoR Ⅰ，pCS2 +-xbra 用 SalⅠ，pCS2+-Sox17α 用 Cla Ⅰ，pCS2+-Sox2 用 EcoR Ⅰ单酶切,随后使用T7 RNA 聚合酶制备反义探针，反应体系中加入Dig-UTP 作为探针标记。
收集并固定爪蛙胚胎,用梯度浓度乙醇进行再水化,用蛋白酶K 处理后进行预杂交和杂交，加入anti-DIG-AP 抗体后，与底物液 BM purple 进行显色反应.
1.2.5 Western blot收集目标胚胎，利用全蛋白试剂盒（南京凯基）提取蛋白, 经 10%SDS-PAGE 电泳分离后， 转移至PVDF 膜上，依次孵育一抗和二抗，最后利用发光液显色. β-actin（鼠源）抗体由美国 Santa Cruz 公司生产,结 蛋白 （兔源 ）抗体购自美国 abcam 公司 ,抗体稀释比例均为1∶1 000.
1.3 统计学方法
定量RT-PCR 所得数据采用平均值 ± 标准误（x ± sx）表示， 利用 SPSS 软件进行重复测量设计的方差分析，P ≤ 0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 结蛋白在不同物种间的序列比对
针对人、小鼠、大鼠、鸡以及热带爪蛙结蛋白的蛋白序列，采用 clustal×2 进行氨基酸序列对比。 结果显示， 结蛋白在 6 个不同物种间存在高度同源性，非洲爪蛙结蛋白氨基酸序列与人类以及小鼠的相似性为79%,与鸡和大鼠的相似性为 80%,与热带爪蛙的相似性为97%. 在结蛋白 3 个主要功能区域中[3],rod区与C 末端 tail 区在 6 个物种间具有高度的相似性,只是head 区物种之间的差异较大，但各物种结蛋白在此区域都有1 个保守区段，由 7 个芳 香 族 氨 基 酸 残 基 和 氨 基 末 端 保 守 的 九 肽（‘SSYRRTFGG’）组成（图1）。
2.2 结蛋白在非洲爪蛙胚胎发育不同时期的表达
为研究结蛋白在非洲爪蛙胚胎发育过程中不同时期的表达,收取受精卵期（st.1）、卵裂期（st.4）、囊胚期（st.7）、原肠胚期（st.11）、神经胚期（st.13、st.18）、尾芽期（st.28、st.32）、蝌蚪期（st.42）的胚胎，提取了不同时期胚胎的总RNA 进行实时定量 RT-PCR检测，结果显示，结蛋白的微弱表达起始于囊胚期，在神经胚早期（st.13）出现明显表达,随后在神经胚期、尾芽期以及蝌蚪期持续高表达（图2A）。
随后利用原位杂交技术对结蛋白在胚胎发育过程中的表达部位进行检测,结果显示,在st.11 时结蛋白表达于外胚层以及中胚层区域，内胚层未检测到其表达;st.18时表达于主干区域、肌、轴旁中胚层以及肌节;st.32主要表达于肌节和心脏等肌肉组织,在神经脊、后脑等神经组织中也有表达（图2B）。
2.3 敲降结蛋白影响胚胎早期发育
通过敲降实验来研究结蛋白在早期发育中的作用时， 首先利用 Western blot 验证 desmin MO 的敲降效率。结果显示，与对照胚胎相比，注射 desminMO 的胚胎中结蛋白的表达量显着减少（图 3A）。
胚胎发育过程中,在st.12 时对照胚胎形成胚孔,而注射desmin MO 的胚胎发育迟缓，其胚孔尚未形成.
当发育至st.32,与正常胚胎相比，敲降胚胎前后体轴明显缩短,头部以及眼也明显变小（图3B、C）。
2.4 敲降结蛋白影响胚层分化
为研究结蛋白敲降后对胚层分化的影响,利用原位杂交技术检测内、中、外胚层标志基因的表达.结果显示,注射desmin MO 的胚胎，其 内胚层标志基因Sox17α， 外胚层标志基因 Sox2 的表达量都明显下降,然而泛中胚层基因Xbra 的表达量无明显变化（图4A）。 利用实时定量 RT-PCR 检测其他标志性基因的表达,发现中胚层基因FGF3、FGF8、NKX2-5、BMP4a、BMP4b、Chordin、DKK1、Wnt8,内胚层标志基因Mixer、Sox17α、GATA4、GATA6,以及外胚层标志基因Sox2、Sox3、Geminin 均受到不同程度的抑制（图4B）。
3 讨 论
细胞骨架包括微丝、微管和中等纤维，在细胞中具有多种重要的生物学功能.
结蛋白是肌细胞中主要的中等纤维,在维持细胞内结构和胞外基质联结中起重要的作用.文献报道,结蛋白基因敲除小鼠在胚胎发育期没有明显异常表型，仅在生后发生肌肉功能障碍。 但是，出生后小鼠肌结构严重破坏和退化，平滑肌发育不全和退化，心肌细胞进行性退化和坏死[16],结合其他文献报道表明结蛋白在肌肉发育中发挥重要作用[10,20].但是结蛋白是否在胚胎发育早期发挥作用尚未阐明. 本文利用非洲爪蛙作为模式动物，研究了结蛋白在胚胎发育中的表达模式及其对早期胚层分化的影响。
首先，通过多重序列比对发现在不同物种间结蛋白的氨基酸序列是高度保守的,提示结蛋白功能的保守性. 进而对结蛋白的表达模式进行进一步的鉴定。 因为以往实验条件的限制，已有的关于结蛋白在细胞分化过程中表达的报道，无论是在体内还是在体外培养条件下的观察, 都是从较晚的时期开始，如7 d 以上的鸡胚，8.25 d 以上的鼠胚，或是十几天以上的鸡、鼠胚胎的肌肉所做的原代培养细胞[21-24],非洲爪蛙结蛋白的表达开始于st.14,高表达于 st.28[25].
本研究利用原位杂交技术检测其表达模式，发现原肠胚期之前的结果与以往报道类似，几乎观察不到阳性染色,但是从 st.18 期已观察到明显表达。 进而利用较为灵敏的实时定量PCR 检测出结蛋白在 st.7 已有微弱的表达,在神经胚早期即开始有明显表达.
这提示结蛋白可能在胚胎发育早期阶段发挥作用.
在获得了结蛋白表达于胚胎发育早期的结果后,利用敲降方法进一步研究其功能,发现结蛋白敲降导致胚胎发育迟缓,同时各胚层标志基因均受到不同程度的抑制,胚层分化受到影响.
研究报道,结蛋白缺陷引起心肌相关疾病[12],而心肌细胞起源于中胚层,同时也受到内胚层信号的影响[26].进一步检测中胚层、内胚层中心脏发育相关标志基因的表达发现,中 胚 层 基 因FGF3、FGF8、NKX2-5、BMP4a、BMP4b,内胚层基因 GATA4、GATA6 也随着结蛋白的敲降而受到了抑制,而这些基因在早期参与或影响了心脏的发育.
以上心脏发育相关基因表达受抑的结果提示,虽然结蛋白缺失小鼠在胚胎期没有明显表型,仅在出生后出现心肌的发育异常,但结蛋白可能在胚胎发育早期阶段即开始发挥作用,最终导致了出生后的发育缺陷,但是对于这一结论还需要进一步的实验来验证.
综上所述,在非洲爪蛙胚胎发育过程中,结蛋白的低水平表达起始于囊胚期,敲降结蛋白阻碍了胚层分化,抑制心脏发育相关标志基因的表达.
