摘要：目的 探讨结核病几种实验室检测结果间的差异。方法 回顾性分析2018年10月至2019年9月本院收治的385例肺结核患者的临床资料，收集患者的Xpert MTB/RIF检测、抗酸染色、痰培养和药敏试验结果，分析Xpert MTB/RIF检测的敏感性和特异性。结果 385例肺结核患者中，Xpert Mtb/RIF检测阳性患者340例（88.3%），对结核分枝杆菌（MTB）的检出率显着高于抗酸染色法（P<0.05）；以痰培养结果为金标准，Xpert MTB/RIF检测MTB和MTB耐药性的敏感度分别为86.7%和93.5%，特异度分别为0.19%和90.4%，经Kappa检验，Xpert Mtb/RIF检测与传统耐药检测具有较好的一致性。结论 Xpert Mtb/RIF检测相比其他几种方法在诊断肺结核及利福平耐药方面更简便、快捷、准确，可用于肺结核患者及利福平耐药患者的筛选，值得临床推广应用。
关键词:肺结核;实验室检测; Xpert MTB/RIF;
Abstract：Objective To explore the difference between the results of several laboratory tests for tuberculosis. Methods The clinical data of385 patients with tuberculosis admitted to our hospital from October 2018 to September 2019 were retrospectively analyzed. The results of Xpert MTB/RIF detection, antacid staining, sputum culture, and drug sensitivity tests were collected and the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF detection were analyzed. Results Among 385 patients with tuberculosis, 340(88.3%) cases were positive for Xpert Mtb/RIF, and the detection rate of Mycobacterium tuberculosis(MTB) was significantly higher than that of antacid staining(P<0.05); using sputum culture results as the gold standard, the sensitivity of Xpert MTB/RIF for detecting MTB and MTB resistance were 86.7% and 93.5%, and the specificities were 0.19% and 90.4%,the Kappa test showed that the results of Xpert MTB/RIF test have good consistency with the traditional resistance test. Conclusion Compared with other methods, Xpert MTB/RIF detection is simpler, faster and more accurate in the diagnosis of tuberculosis and rifampicin resistance. It can be used for screening tuberculosis patients and rifampicin resistance patients, which is worthy of clinical promotion and application.
肺结核是一种常见的慢性传染性疾病，病原体为结核分枝杆菌（MTB），具有发病隐匿、耐药性强的特点，死亡率较高，已成为全球第九大死因[1]。WHO统计结果显示，2018年全球约有1 000万人患结核病[2]；我国是肺结核高负担国家，患者数量居世界前列，是我国重点防治的传染病之一。有研究显示，我国每年新发肺结核患者高达100万，已成为我国第二大传染病[1]。痰涂片抗酸染色、MTB培养（TB培养）是目前肺结核常用的诊断方法，利福平耐药实时核酸扩增检测法（Xpert MTB/RIF）是近年由美国研发的新型MTB及利福平耐药检测方法，其以全自动半巢式荧光定量PCR为基础，选取rpo B基因作为靶基因，在2 h内即可完成痰标本的MTB及利福平耐药性检测。WHO也已推荐Xpert MTB/RIF检测作为肺结核的首选筛查方法，并在全球多个地区的临床研究中被证实具有优异的检测性能[3]。本研究分别采用Xpert MTB/RIF技术、抗酸染色及TB培养方法对385例肺结核患者的痰液标本进行检测并作比较，以评估各实验室检测技术，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
回顾性分析2018年10月至2019年9月本院收治的385例肺结核住院患者的临床资料，其中男205例，女180例；年龄12～88岁，平均（35.35±17.97）岁；就诊类型：初治280例，复治105例。本研究已通过医院伦理委员会审核批准。
1.2 方法
收集患者咳出的痰液标本，分别进行抗酸染色、TB培养和Xpert MTB/RIF检测，并对培养出的菌株进行RIF药敏试验及MTB常规药敏实验。抗酸染色、TB培养：具体步骤参照《结核病诊断实验室检验规程》开展[4]，并采用生化鉴定方法对菌型进行鉴定，鉴定为MTB的菌株进行药敏试验。Xpert Mtb/RIF技术检测：检测所需的Gene Xpert Dx仪器、检测盒和SR均由美国Cepheid公司提供。取1 m L痰样本加入前处理管中，再加入2倍样本体积的SR标本处理液，涡旋振荡约15～30 s混匀，静置15 min，使样本充分液化。打开试剂盒，取2 m L处理后液化样品由加样孔加入试剂盒中，再将试剂盒置于仪器检测模块中，进行自动化检测。检测结束后，可直接读取检测结果。
1.3 观察指标
收集患者Xpert MTB/RIF检测、抗酸染色、痰培养和药敏试验结果，分析Xpert MTB/RIF检测的敏感性和特异性。
1.4 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料以“”表示，比较采用t检验，计数资料用[n（%）]表示，比较采用检验，一致性采用Kappa检验计算，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3种检测方法对痰MTB检测结果分析
385例肺结核患者中，Xpert Mtb/RIF检测阳性患者340例（88.3%），阴性患者45例（11.7%）；抗酸染色法阳性患者167例（43.4%），阴性218例（56.6%);TB培养法阳性患者331例（86.0%），阴性54例（14.0%);Xpert MTB/RIF检测、TB培养法对MTB的检出率高于抗酸染色法，差异均有统计学意义（P<0.05);Xpert MTB/RIF检测与TB培养法对MTB的检出率比较差异无统计学意义，见表1。
表1 3种检测方法结果比较[n(%)]
注：与抗酸染色法比较，aP<0.05
2.2 Xpert Mtb/RIF检测MTB的诊断效能
以TB培养法结果作为确诊肺结核的金标准，经计算，Xpert MTB/RIF检测痰涂片抗酸染色阳性患者的MTB敏感度为94.3%、特异度为12.5%；检测痰涂片抗酸染色阴性患者的MTB敏感度为79.7%、特异度为0.00%；全部肺结核患者的诊断敏感度为86.7%，特异度为0.19%，见表2。
表2 Xpert Mtb/RIF检测与TB培养法结果比较[n(%)]
2.3 Xpert Mtb/RIF检测与传统药敏法检测利福平耐药比较
以临床常用的传统药敏检测作为判断耐药性的金标准，共检测了166例患者的利福平耐药性，经计算，在抗酸染色阳性的97例患者中，Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药阳性患者46例，阴性51例，敏感度为95.0%，特异度为86.0%；在抗酸染色阴性的69例患者中，Xpert Mtb/RIF检测利福平耐药阳性患者21例，阴性48例，敏感度为86.4%，特异度为95.7%；所有肺结核患者经Xpert Mtb/RIF检测计算得到的利福平耐药的敏感度为91.9%，特异度为90.4%，见表3。在同时显示抗酸染色阳性和Xpert MTB/RIF检测阳性的肺结核患者中，采用Kappa检验计算Xpert MTB/RIF法和传统药敏法检测利福平耐药的一致性，Kappa值为0.810>0.75，两种检测利福平药敏的方法所得结果具有较好的一致性。
表3 Xpert Mtb/RIF检测与传统药敏检测利福平耐药比较[n(%)]
3 讨论
结核病是我国发病率最高的细菌性传染病，其中又以肺结核发病人数最多，随着疾病的进展或反复发作，重症结核、MDR、TB、XDR、TB的患者比例逐渐升高，已引起国家及社会的广泛关注[5]。既往临床缺乏准确、快速的诊断方法，常造成患者的漏诊，得不到及时治疗，进而导致不良预后。肺结核的早期诊断是患者及时正确治疗的前提。传统的痰涂片抗酸染色法是临床广泛用于结核快速诊断的方法，然而其敏感性低，无法区分非结核分枝杆菌，造成漏诊率、误诊率较高。而作为结核病诊断金标准的痰培养通常需4～6周才能作出诊断，在此基础上进行药敏试验，又需2～4周时间，因而无法满足临床及时诊断、及早治疗的需要[6]；因此，临床急需一种简便、快速、精确的诊断方法用于结核病患者的临床识别及用药指导。
目前，新型分子诊断技术发展迅猛，可快速、精确诊断结核病，Xpert Mtb/RIF检测技术是由美国Cepheid公司研发的用于结核病诊断及利福平耐药的分子诊断技术，通过整合传统PCR检测的多个环节，全自动的将痰液样本转输至试剂盒，完成核酸的提取、扩增、目标序列检测等过程[7,8]。其工作原理是设定6种分子探针，特异性结合rpo B基因的81 bp区域，以此反映MTB是否对RIF耐药；同时，设计了另1个球芽孢杆菌特异探针作为内参对照，用于评估DNA扩增效率。绝大多数RIF敏感菌株在81 bp处具有相同的核酸序列，而RIF耐药的主要原因均是由rpo B基因突变造成的，因此，可将rpo B基因作为RIF耐药基因，用于测定菌株的RIF耐药性[9,10]，具有简便、快捷、灵敏度高的特点，且不产生气溶胶，降低了MTB生物危害的风险，得到WHO的高度推广。
本研究结果显示，385例肺结核样本中，Xpert Mtb/RIF检测的阳性率为88.3%，显着高于抗酸染色法的阳性率，而与耗时较长的TB培养比较差异无统计学意义，与国外相关研究结果相似[11,12]。在以痰培养为诊断肺结核金标准的后续研究中，Xpert法对MTB诊断的总敏感性高达86.7%，与国外相关研究结果相似[13]，而Xpert法特异度仅为0.19%，考虑特异度低的原因可能与假阳性样本量及非结核患者的数量不足有关。其中在抗酸阳性患者中，Xpert法检测MTB的敏感度高达94.3%，而特异度只有12.5%，分析7例假阳性患者后发现，虽然不符合肺结核的金标准诊断，但根据症状及治疗效果与临床诊断相符，也造成了较低的特异性；在抗酸染色阴性的患者中，Xpert法检测MTB的敏感度为79.7%，而特异性为0.00%，均低于总敏感性和特异性，除前述原因外，还可能与抗酸染色阴性的患者负荷菌量较低，对检测的要求更高有关，也表明Xpert法相交抗酸染色法能显着提高患者诊断敏感性及检出率。有研究显示，Xpert MTB/RIF检测技术对肠结核、骨结核等肺外结核的诊断中，其敏感性显着高于抗酸染色法，而与TB快速培养法的敏感性相当。有研究表明，Xpert MTB/RIF检测技术在运用于肠结核等肺外结核患者中，敏感度明显高于涂片抗酸染色法，与快速结核分枝杆菌培养法基本相同，特异度较高[14,15]。Xpert MTB/RIF技术对MTB的高敏感度有效提高了肺结核的检出率，对肺结核快速筛查、早期诊断与治疗具有重要意义。
在对Xpert法检测利福平耐药的研究中，以传统比例法药敏结果作为判断耐药的金标准，Xpert法检测MTB对利福平耐药的敏感性和特异性均较高，分别为93.5%和90.4%，与传统药敏结果行Kappa检验，表明Xpert法与传统比例法对利福平耐药的检测有着良好的一致性（Kappa值=0.913），与国外相关研究结果相似[16]。此外，在抗酸染色阳性和阴性患者中，均表现出较高的敏感性和特异性，表明Xpert法在负荷菌量偏低的患者中仍能发挥良好的检测效能。然而，由于其特异性检测利福平耐药，而无法检测其他一线或二线抗结核药物，导致临床适用性明显降低，尤其对结核高发地区，难以将其耐药性结果作为治疗依据；但Xpert法为结核病患者提供了快捷、简便的诊断方法，也为结核病诊断研究提供了新思路，对于全球结核病的防控具有重要意义。
综上所述，Xpert Mtb/RIF技术在结核病检测中具有简便、快捷、精确度高的特点，可用于肺结核患者及利福平耐药患者的筛选，具有广阔的应用前景；然而该方法也具有仪器昂贵、检测成本高的缺点，在临床应用中，出现与培养结果不一致的现象，尤其对于治疗后痊愈的肺结核患者，因此，在临床检测中，需对检测结果进行正确分析，对临床症状明显的阴性患者，结合痰液培养等多种方法，综合判断，降低漏诊的发生率。
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