摘 要： 登革热(dengue fever)是一种由携带登革病毒(dengue virus)的蚊媒叮咬引起的急性传染性疾病。登革热已经在100多个国家和地区流行,每年约有3.9亿人感染。2019年初世界卫生组织(WHO)将登革病毒引起的登革热疾病列为2019年全球健康面临的十大威胁之一。自2019年年初至8月底,登革热疫情已在全球20多个国家和地区暴发,感染人数超过150万例。登革热发病机制尚不明确,且迄今没有特效药,疫苗预防和蚊媒控制是遏制登革病毒传播的有效手段。本文阐述近年来登革疫苗的研发和蚊媒控制方面的最新进展,提出未来登革疫苗发展有望在优势抗原重新组合、开发新型递送系统等方面获得突破,基因编辑等新型技术的兴起可促进蚊媒控制研究的发展。
关键词： 登革热; 登革病毒; 蚊媒介; 疫苗; 预防与控制;
Abstract： Dengue fever is an acute infectious disease caused by mosquito vector bites carrying dengue virus. Dengue fever has been prevalent in more than 100 countries and regions, with about 390 million people infected each year. In early 2019, the World Health Organization(WHO)listed dengue fever caused by dengue virus as one of the top 10 threats to global health in 2019. From the beginning of 2019 to the end of August, dengue fever outbreaks have occurred in more than 20 countries and regions around the world, with more than 1.5 million cases of infection. Up to date, it is not clear about the pathogenesis of dengue fever, and there is no target drug. Vaccine prevention and mosquito vector control are effective means to control the transmission of the virus. Vaccine prevention and mosquito vector control are effective means to curb the spread of dengue virus. This article reviews the latest progress in the research and development of dengue vaccine and mosquito vector control in recent years. The development of dengue vaccine in the future is expected to make breakthroughs in the reassembly of dominant antigens and the development of new delivery systems. The rise of new technologies such as gene editing will promote the development of mosquito vector control research.
Keyword： dengue fever; dengue virus; mosquito vector; vaccine; prevention and control;
登革热(dengue fever,DF)是一种由携带登革病毒(dengue virus,DV)的蚊媒叮咬引起的急性传染性疾病。其病原体登革病毒属于黄病毒科中的黄病毒属,由埃及伊蚊(aedes aegypti)或白纹伊蚊(aedes albopictus)携带传播。由于蚊媒滋生迅速,登革热的传播因此也迅速而广泛[1]。据世界卫生组织(WHO)统计显示,登革热目前已经在100多个国家和地区流行,全球有25～30亿人生活在登革热流行区域,每年约有3.9亿人感染[2]。多数情况下,登革病毒感染引起的登革热临床症状较轻,随病程进展可自行痊愈,但也有少数感染者病程逐渐加重,发展为登革出血热(dengue hemorrheagic fever,DHF)及登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS),后者病死率极高[3]。登革休克综合征除了表现出严重的出血倾向和出血性休克之外,主要还可表现为剧烈头痛、恶心、呕吐、意识障碍、颈强直等,多数患者最终因中枢性呼吸衰竭和出血性休克在24 h内死亡。近10年来,登革热在全世界范围流行有加剧趋势,已经成为全球性公共卫生难题[4]。
1、 登革热已成为全球健康重要威胁
2019年初WHO将登革病毒引起的登革热疾病列为2019年全球健康面临的十大威胁之一。自2019年年初至8月底,登革热疫情已在全球20多个国家和地区频频暴发,其中以菲律宾、越南、泰国、马来西亚等东南亚国家和南美洲的巴西疫情最为严重;全球登革热病例总数已超过150万例,引起全球各界人士广泛关注[3]。以部分东南亚国家为例,菲律宾在2019年6月15日报告的登革热病例为77 040例,而在2019年8月3日已急剧上升至188 562例,前后相隔不到2个月时间,并且又在2周后突破了20万例(WHO官方数据显示达到229 736例),死亡人数958人。截至2019年8月17日,马来西亚登革热病例累计超8.5万例,是2018年同期2倍以上,其中121人死于登革热;2019年上半年,越南的登革热病例累计达8.8万例,较2018年同期增加2倍以上,其中至少6例患者死亡;2019年1月至7月,柬埔寨有超过1.4万名儿童感染登革热。截至2019年7月7日,老挝有超过1.4万人感染登革热,31人死亡。自2019年年初至8月24日,新加坡也发现了10 683例登革热病例,是2018年同期的6倍。
2、 登革热的预防与媒介控制
2.1、 登革病毒的可能致病机制
登革病毒基因组全长约11 kb,为单链正链RNA病毒。从5′端开始依次编码了11个蛋白,包括4个结构蛋白(C、PrM、M和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。登革病毒颗粒为球形20面体,直径约55 nm。病毒颗粒外被脂蛋白包膜,并具有包膜刺突。病毒包膜的外层含有包膜蛋白E,内层含有膜蛋白M。登革病毒依E蛋白抗原性不同被分为4种血清型,分别为DV1、DV2、DV3和DV4。各血清型病毒之间抗原性有交叉,其中登革病毒2型较其他3种血清型差异最大。
登革热发病机制尚不明确,迄今尚无特效药物,临床治疗只能以支持治疗为主。已有的临床转化医学和相关疫苗研究揭示其可能的机制包括抗体依赖增强作用和细胞因子风暴作用。① 抗体依赖增强(antibody dependent enhancement,ADE)作用[5],已有的临床转化医学研究证实,登革病毒感染后产生的抗体除了具有中和作用的中和性抗体,还有非中和性抗体。非中和性抗体在异种血清型再次感染中显着增加。一方面,通过与病毒颗粒相结合形成病毒抗体复合物,并通过抗体的Fc受体(FcR)结合进入单核-巨噬细胞,增强登革病毒感染,经血液循环加重全身性感染。另一方面,感染的单核-巨噬细胞经病毒颗粒或病毒抗原抗体复合物等刺激,可以诱导激活释放大量炎性因子和趋化因子,引起弥散性血管内凝血(DIC)、出血、休克等一系列病理过程[6]。 ② 细胞因子风暴(cytokine storm)[7,8],指机体感染登革病毒后引起体液中多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等迅速、大量产生的现象。这种现象在登革出血热和登革休克综合征患者中非常常见。异种血清型再次感染诱发交叉反应性CD4+细胞活化,或辅助交叉反应性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)活化。活化的病理反应性T细胞释放大量炎性细胞因子如IL-2、IFN-γ、组胺、过敏素C3a和C5a等,加重登革出血热和登革休克综合征患者休克、循环衰竭和出血等症状。
2.2、 登革疫苗研究进展
登革热迄今为止没有特效药,疫苗是遏制病毒感染的最有效手段。一个理想的疫苗应当能够产生有效的保护性免疫应答,包括体液免疫和/或细胞免疫应答。然而,正如前述的可能致病机制以及可能尚未明确的机制,使得登革病毒疫苗研究困难重重,充满了挑战。下面主要介绍进入临床试验的几种疫苗[9]。
2.2.1、 减毒活疫苗[2]
登革疫苗的研究可以追溯到1976年,WHO东南亚区域研究咨询委员会(SEA/ACMR)第1次会议在新德里召开,将登革热研究纳入了优先事项。在1976年8月的SEA/ACMR第2次会议中,再次明确登革热研究的重要性和紧迫性,并在第2年2月明确了疫苗研究的重要性。1978年,WHO指定泰国Mahidal大学承担疫苗研发任务。1993年,Mahidal大学与赛诺菲巴斯德签署合作协议,共同研发登革热四价减毒活疫苗。在1980-1995年,WHO历时15年先后投入250万美元完成了从研发到临床试验的一系列工作,然而最终以失败告终。后来,美国国防部下属的沃尔特里德陆军研究所(WRAIR)和葛兰素史克公司也用相同技术研发了减毒活疫苗TDENV LAV,临床试验中出现免疫应答不平衡、效价不理想,以及出现发热、病毒血症等不良反应,最终葛兰素史克公司退出,WRAIR则将此作为补强剂。
2.2.2、 亚单位疫苗[9]
默沙东公司开发的V180疫苗,以包膜E蛋白的保外区作为抗原,因胞外区序列占E蛋白总序列的80%,因此又被称为DNV-80E疫苗。E蛋白是登革病毒最重要的抗体靶点,含丰富的中和抗原表位和血清特异性表位,可诱导中和性抗体,因此被广泛用于亚单位疫苗设计。4种血清型登革病毒的V180蛋白在果蝇S2细胞表达纯化后,与SSCOMATRIXTM佐剂和NS1蛋白混合形成V180疫苗,分别于第0、1、2、3月共4次接种无登革病毒感染史的健康人群。该疫苗可诱导产生针对4种血清型的中和抗体和细胞免疫,但无论是单价免疫还是四价免疫,所产生的中和性抗体均出现了免疫应答不均衡,即受试者产生的DV1、DV2中和性抗体总是高于DV3、DV4型。该项目临床试验从2012年正式启动,2014年完成临床Ⅰ期研究,后续未见该疫苗的进一步研究报道。近年针对登革病毒不同抗原蛋白设计的DNA亚单位疫苗有新的进展[6]。包括针对NS1\NS3\NS5设计的DNA重组疫苗可以诱导较宽谱系的T细胞应答、等价E蛋白二聚体疫苗剔除了前M蛋白与E蛋白的融合环,有效规避了ADE交叉反应风险、通过登革病毒中和抗体反向寻找中和性表位均取得较理想效果,有待后期临床试验验证[10,11,12,13]。
2.2.3、 灭活纯化疫苗[9]
美国国防部WRAIR和葛兰素史克公司再度联手,并联合巴西卫生部下属的Fiocruz和Bio-Manguinhos共同开发了灭活纯化疫苗TDENV PIV。该疫苗主要成分为灭活纯化的登革病毒,配合佐剂进行接种,只接种2次,间隔4周。2012年,分别在美国和波多黎各(分别代表了登革热的低流行地区和高流行地区)启动了该疫苗的临床试验。原计划在2018年公布试验结果,但至今仍未见报道。该疫苗致命缺点是免疫原性较低,改进佐剂后在猴子实验获得较好效果[14]。
2.2.4、 嵌合型减毒活疫苗[15]
采用基因重组技术,以黄热病毒基因组为基本骨架,将PrM、E蛋白基因置换成登革病毒相应的蛋白基因,获得登革病毒嵌合型减毒活疫苗。赛诺菲巴斯德公司的CYD-TDV、武田公司的DENVax和美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所的TV003均属于该类疫苗。赛诺菲巴斯德公司的CYD-TDV疫苗(商品名Dengvaxia)需接种3次,分别于第0、6、12月接种。该疫苗临床试验从2009年启动,2014年完成Ⅲ期随机试验,2015年12月在墨西哥、菲律宾和巴西依次获批上市,成为全球首个获批的登革热疫苗。到目前为止,该疫苗在墨西哥、菲律宾、巴西、沙尔瓦多、哥斯达黎加、巴拉圭、危地马拉、秘鲁、印尼、泰国、新加坡等11个国家被批准上市,在委内瑞拉、洪都拉斯、马来西亚、澳大利亚、阿根廷、孟加拉、柬埔寨和美国等9个国家获得批准[16]。然而,2017年菲律宾发生了十几例儿童接种该疫苗后出现重症登革热甚至不幸死亡的事件,给疫苗研制者当头一棒。菲律宾立即停止了该疫苗销售并要求巴斯德公司赔偿[17,18]。随后的研究表明,该疫苗仅对有登革病毒感染史的人群适用,对无感染史人群有加重感染后病情的风险[19]。出于对消费者负责的宗旨,2017年12月赛诺菲主动提议相关批准国家不再继续使用该疫苗。2019年5月,美国FDA批准该疫苗可以用于有登革病毒感染史的9～16岁青少年[20]。
虽然对2000-2017年公开发表的疫苗临床试验数据进行系统Meta分析证实赛诺菲疫苗没有保护效果[21],鉴于近年来全球登革疫情的严峻性,WHO推荐在登革流行地区对经病毒学鉴定有明确登革病毒感染史人群可以条件限制性接种[22]。既往登革病毒感染史直接影响赛诺菲疫苗的安全性和有效性。遗憾的是,目前临床尚无可靠的病毒学证实登革病毒感染的快速诊断检测方法[23]。
美国过敏与传染病研究所的TV003疫苗于2011年启动临床试验,目前在巴西进行大规模临床试验,在泰国和孟加拉国进行Ⅱ期试验。近期临床试验结果显示良好免疫原性和安全性[9,24]。日本武田公司的DENVax(TDV,TAK-003)疫苗于2010年正式启动临床试验,2017年11月公布的Ⅱ期结果显示2～17岁青少年儿童接种后应答效果持续18个月,在2018年完成临床Ⅲ期试验,临床试验结果显示该疫苗具有良好免疫原性和安全性[25,26]。
3、 登革病毒媒介控制
登革热主要经由伊蚊叮咬而传播,因此研究蚊媒的防控对于此类疾病的防治非常重要。由于传统的化学药物方法对该类蚊媒控制效果不佳,常用化学杀虫剂DDT长期使用容易产生耐药,且对环境有污染危害,因此采用生物蚊媒防控的策略应运而生[27]。
传统的生物防控策略利用微生物杀虫,如苏云金芽孢杆菌BT或真菌杀虫因效率低限制了应用。在过去20年里,各种创新性的蚊虫控制策略被研发出来,以减少携带致病病毒和细菌的蚊虫传播。这些策略包括减少蚊虫种群数量(称为种群抑制)或通过自然种群传播基因修饰或细菌感染使野生蚊虫无法传播传染病(称为种群置换)[27,28]。例如,生活在昆虫寄主细胞中的母系遗传的沃尔巴克菌属的细菌生活在昆虫寄主的细胞中,它们是母系遗传的,是一种既能抑制种群又能进行种群置换的方式影响宿主的繁殖。即,当感染某种沃尔巴克菌的雄性蚊子被释放并与未感染同一种沃尔巴克菌的野生雌性蚊子交配时,雌性蚊子就无法产生活卵。或者,当释放所有大量感染沃尔巴克菌的雄性和雌性蚊子时,将使蚊子传播病毒的能力降低,可能导致这种菌株在野生种群中传播,从而使蚊子传播病毒的能力降低。目前,昆虫不育技术(sterile insect technique,SIT)已被成功运用于农业生产,有效控制了多种重要农业害虫的数量。该技术通过释放经辐射导致的绝育雄虫与野生雌虫交配,使其无法产生子代,达到降低害虫种群数量的目的。SIT控制蚊虫的前景尚在探索中,目前该技术存在的一个缺点是辐射会降低雄蚊交配的竞争力和生存力。
昆虫不相容技术(incompatible insect technique,IIT)有望克服SIT技术的某些不足。该技术主要通过释放携带有与野生雄蚊不同种沃尔巴克菌(wolbachia)的雄蚊,诱发胞质不容使雌蚊不育。历经50年相关探索研究证明,SIT、IIT联合使用可以获得理想效果,尤其在近2年获得了突破性进展[29]。2016年,澳大利亚O’NEILL等[30]首次报道了小规模现场试验释放人工转染Wolbachia的蚊虫进行种群压制。2019年7月18日中国奚志勇团队通过现场试验证实IIT-SIT相结合可以对蚊媒种群进行区域性控制[31]。该团队通过胚胎显微注射技术,将库蚊体内的Walbachia wPip转移到白纹伊蚊HC蚊株体内,同时, 对HC雌蚊进行低剂量辐射后,按2%比例将其释放混入野生种群中。经过2～3年持续释放,在2个试验现场基本清除或接近清除了白纹伊蚊的种群数量,2年内野生成蚊数量平均减少了83%～94%,持续6周内检测不到任何成蚊。野生幼虫数量年度平均减少超过94%,持续13周未检测到存活蚊卵。该研究结果被WHO和国际原子能机构等联合国机构认可并向全球推荐。
4、 展望
毋庸置疑,发展和改进安全有效的登革疫苗是应当优先考虑的问题[9]。虽然赛诺菲巴斯德公司的疫苗研制失败,但其临床试验结果和失败经验给了我们更多启示,对今后登革疫苗研发有很好的借鉴意义。比如临床试验已经明确建立的噬斑抑制中和实验(PRNT)是今后评价疫苗中和性抗体的金标准[32];一个理想的登革热保护性疫苗应该同时具备适度的天然免疫应答,包括中等强度的炎性因子(IL-6,IL-8,TNF-α, IFN-α/β)以及连接天然免疫和获得性免疫的趋化因子,B细胞应答水平产生高效价、特异性、交叉反应性的中和性抗体[33],T细胞水平应答产生结构蛋白和/或非结构蛋白特异性的Th1/CTL,分泌可控性炎性功能因子,IFN-γ浓度高于TNF-α。细胞因子释放水平和相关动力学谱直接影响疫苗保护性结局[34]。虽然登革疫苗进展困难重重,但世界各国仍然在前仆后继地进行相关研究,以期攻克这个难题。相关候选疫苗临床试验结果也令人期待。我国清华大学程功团队,军科院秦成峰、秦鄂德团队,首都医科大学安静团队,中科院金侠团队,陆军军医大学饶贤才团队和李晋涛团队等均致力于登革疫苗研究,也获得不少令人鼓舞的前期实验结果和令人期待的应用前景[35,36,37,38,39,40]。
此外,生物技术的快速发展给媒介防控带来无限可能,未来蚊媒控制可能在以下几个方面取得突破[41,42]:昆虫合成生物学研究,整合合成基因和标记性状,降低传染能力,控制或清除某类有害种群;基于核酸酶系统CRISPR-cas9人工构建自私DNA系统,其具有极强自我繁殖能力,可以在某个种群或多种群间疯狂传播[43];基因工程编辑技术建立显性不足基因驱动系统,精准靶向某个害虫种群,而不是整类种群进行控制[27]。
登革热在全球已成为一个严重的公共卫生问题。全球变暖使原本仅肆虐于热带和亚热带地区的登革热逐渐开始向温带和寒带地区和国家扩散。据报道,伊蚊历来只生活在海拔1 000 m以下地区,但随着气候变暖,导致南美海拔1 350～-2 200 m高的地区竟已也发现开始有伊蚊出没。同时,愈发频繁的国际交流和经济贸易、旅游的发展将加剧登革热在世界范围内的蔓延。可以预见,21世纪登革热流行呈上升趋势,未来防控任务将更加严峻。防重于治,登革疫苗的研究和蚊虫防治将是未来登革热防控研究的主旋律。
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