摘要：以37份胡萝卜种质资源为材料，通过对其表型性状统计、变异系数和多样性指数分析以及主成分分析和SSR基因型鉴定，进行遗传多样性及亲缘关系研究。结果表明，胡萝卜种质资源9个数量性状中叶基盘宽度变异系数最大，肉质根长度变异系数最小；9个数量性状的平均多样性指数（1.60）高于其他18个质量性状的平均值（0.72）;2个主成分对变异的累计贡献率达90.91%,2个主成分分别主要由单根质量和根长决定；SSR聚类分析结果将供试胡萝卜种质资源分为3类，第1类为淡黄色材料（A23），第2类包括白色（A15）和橙色资源（A17），第3类包括橙色、紫色和黄色资源。
关键词：胡萝卜; 表型性状; 变异系数; 多样性指数; SSR;
Diversity and Cluster Analysis of Carrot Germplasms
CHANG Shuangfeng LIU Zhenzhen ZHAO Yuxuan WANG Xinyu WU Zhe
College of Horticulture,Shanxi Agricultural University
Abstract：This study investigated the genetic persion and genetic relationship of 37 carrot germplasms, through the statistical analysis of phenotypic traits, coefficient of variation, Shannon's persity index analysis, principal component analysis and genotype identification of SSR. The results showed that the coefficient of variation was the highest for leaf blade width and the lowest for fleshy root length, among the nine quantitative traits of carrot germplasms. The mean Shannon's persity index of the nine quantitative traits(H'=1.60)was higher than that for the other 18 qualitative traits(H'=0.72). The two principal components, which were dominated by the single root's quality and length, respectively, accounted for 90.91% of the total variations. Based on the SSR cluster analysis, the 37 carrot germplasms were pided into three categories, the first type was light yellow materials(A27), the second type included white(A15)and orange materials(A17), and the third type included orange, purple and yellow materials.
胡萝卜（Daucus carota L.var.sativa DC.）是伞形花科胡萝卜属2年生草本植物，其肉质根中含有丰富的类胡萝卜素，是提供人体所需类胡萝卜素的主要蔬菜之一[1,2]。我国是世界上胡萝卜种植面积最大的国家之一，到2012年我国胡萝卜种植面积达到47.2万hm2，占世界胡萝卜种植面积的39.4%。胡萝卜种质资源丰富，全世界共有5 600份，我国仅搜集保存了389份[3]。为丰富我国胡萝卜种质资源，对其遗传多样性分析和亲缘关系鉴定是新品种选育的关键，同时也为挖掘优良基因奠定了基础。近年来，对胡萝卜种质资源遗传多样性的研究已有相关报道。赵彦等[4]采用RAPD分子标记技术，将34份胡萝卜种质资源材料聚为5类，8个亚类。马振国等[5]结合表型性状和SSR标记对70份国内外胡萝卜种质材料进行分析，结果表明，橘红色栽培品种的多样性指数低于地方资源，地方资源的平均多态性位点高于橘色栽培种，聚类分析将这些资源分为2组。但已有研究所关注的表型性状较为有限，不利于对种质资源综合性状的利用。而表观形态学鉴定及聚类分析是当前园艺植物中进行种质资源调查的2种常用方法，目前已被应用在多种作物上，如大麦[6]、大豆[7]、甜瓜[8]、柑橘[9]等，但在胡萝卜作物上还未被应用。
本研究从山西农业大学园艺学院胡萝卡课题组收集的种质材料中筛选了37份具有代表性的地方资源和栽培品种，对田间27个主要的表型性状进行调查研究，采用43对多态性SSR引物分析不同种质材料间的亲缘关系，旨在为胡萝卜种质资源的进一步利用、创新和遗传改良奠定基础。
1材料和方法
1.1试验材料
表1 供试胡萝卜种质资源
试验所用材料37份，包括橙色材料28份、黄色材料4份、紫色材料4份、白色材料1份，由山西农业大学园艺学院收集。胡萝卜种质资源材料信息如表1所示。
1.2试验方法
试验材料于2017年春季在山西农业大学园艺学院试验站种植。采用露地半高垄方式栽培，行距15 cm，株距10 cm，每份材料种植10株，调查3～5株，常规管理。
1.2.1胡萝卜田间表型性状的调查及分析
田间表型性状主要分为2类，一类为地上部，包括叶基盘宽度、叶基盘位置、叶型、叶数、叶裂深浅、叶色、叶长、叶宽、叶面绒毛、叶柄色、叶柄基部花青素；另一类为地下部，包括根长、根粗、根形、根肩部大小、根肩型、根肩绿色程度、根肩绿肉程度、根尖形状、根表皮状况、根眼大小、根表皮颜色、肉质根肉色、根形成层颜色、根心柱色、根心柱大小、单根质量。具体鉴定标准及方法依据胡萝卜种质资源描述规范和数据标准进行[10]。
将27个性状的测量值分别用Excel计算出最大值、最小值、平均值（X）、标准差（σ），然后进行10级分类[11]，其中，10级≥X+2σ，1级<X-2σ，中间每级别相差0.5σ；由标准差和平均数计算变异系数（CV）；根据每个性状占总分数的百分比计算其多样性指数（H′）。
使用SAS 9.2软件对27个田间表型性状进行主成分分析和聚类分析。
式中，Pi为某性状第i级材料份数占总份数的百分比。
1.2.2 SSR标记分析
采用CTAB法提取胡萝卜基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop2000C核酸仪检测定其纯度和浓度。
从CAVAGNARO等[12]研究得出的304对SSR引物中选择均匀分布于9条染色体上的72对进行多态引物的筛选，筛选出的43对引物如表2所示。其中，PCR反应体系的d NTP、Taq酶购于南京擎科生物有限公司。
PCR反应体系及扩增条件为：PCR反应体系10μL，包括dd H2O 1μL、Mix Buffer 5μL、正向引物（50 ng/μL)1μL、反向引物（50 ng/μL)1μL、模板DNA 2μL;PCR扩增条件：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,34个循环；72℃延伸10 min。4℃保存。
银染体系为：7.2%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，180 V恒压，电泳1.5 h左右，银染显色，在荧光灯屏上观察并拍照。在相同位置出现条带的记为“1”，无条带的记为“0”。统计好后，将数据以Microsoft Excel5.0/95工作薄的格式存盘，利用NTedit导入文件，存为NTS格式；利用NTSYS pc 2.0软件处理，进行聚类分析[13]。
表2 43对多态性丰富的SSR引物序列
2结果与分析
2.1表型性状分析
由表3可知，37份胡萝卜种质资源平均叶基盘宽度为22.8 mm，极差为95.6 mm；平均叶片数为11片，极差为12片；平均叶长为39.9 cm，极差为42.0 cm；平均叶宽为19.9 cm，极差为25.0 cm；平均单根质量为125.9 g，极差为267.5 g；平均根心柱大小为16.0 mm，极差为16.6 mm；平均根长为156.6 mm，极差为99.1 mm；平均根尾粗度为38.3 mm，极差为36.6 mm；平均根头粗度为10.2 mm，极差为20.9 mm。9个数量性状的变异系数平均值为33.3%，其中，叶基盘宽度、肉质根单根质量和根头粗度的变异系数分别为64.6%、50.6%和36.2%，均超过平均值，说明这3个性状变异丰富；其余6个数量性状均小于平均值，表明其遗传特性相对稳定。9个数量性状的多样性指数平均值为1.60，叶宽最大，为1.97，叶基盘宽度最小，为1.09，说明这9个性状在每组内分布情况相似。
表3 供试胡萝卜种质资源的数量性状分析
从表4可以看出，37份胡萝卜种质资源材料分布较为广泛，如叶色中绿色、灰绿色和紫绿色的分布频率分别是78.4%、2.7%、13.5%，其中，未发现黄绿色或深绿色（分布频率为0）叶片；叶柄基部花青素由轻到重的分布频率依次为无（51.2%）、轻（32.4%）、中（5.4%）以及重（10.8%）；根肩绿色程度根据无或很少、少、中等、多、非常多的比例分别为13.5%、18.9%、10.8%、18.9%、37.8%；另外，在根表皮颜色中，白色占2.7%，黄色占10.8%、橘黄色占75.7%、紫红色占8.1%、紫色占2.7%，没有发现橘红色和红色根表皮材料。18个性状的平均多样性指数为0.72，根肩绿色程度的多样性指数最大，为1.51;11个性状多样性指数介于0和1之间，分别为叶柄色（0）、叶基盘位置（0.25）、叶型（0.13）、叶裂深浅（0.76）、叶色（0.56）、根肉色（0.82）、根型（0.25）、根肩型（0.25）、根尖形状（0.54）、根表皮状况（0.4）和根表皮颜色（0.85），说明供试胡萝卜种质材料在这11个性状上表现型类型较少或类型分布不均匀。
表4 胡萝卜种质资源质量性状分布频率和多样性指数分析
2.2主成分和聚类分析
基于表型性状的主成分分析，得出遗传相关矩阵的特征值，选取前2个较大的特征值，能够代表27个田间性状90.91%的变异。由表5可知，第1主成分特征值为2 904.435，贡献率达77.310%，主要由单根质量（0.973）决定；第2主成分特征值为510.864，贡献率达13.600%，主要由根长（0.988）决定。
表5 27个田间性状的主成分分析
对37份胡萝卜种质进行聚类分析，在距离系数约为1.07的位置，将其分为六大类群（图1），其中，第1类包括A10，为常规品种，橙色；第2类包括A35，为1代杂种，橙色；第3类包括A8，为常规品种，橙色；第4类包括A13，也是常规品种，橙色；第5类包括A16、A24、A37、A9和A2，除A37为橙色外其他都是紫色；第6类包括白色A15，浅黄色A23，黄色A14、A18、A21、A25以及其他橙色资源。
2.3 SSR标记的聚类分析
通过对72对引物的筛选，共筛选出43对多态性丰富、条带清晰的SSR引物（以引物GSSR-6为例，图2),43对SSR引物共扩增出171条带，其中，多态位点153个，多态率为89.5%，每对引物扩增出的条带数为1～8条，平均每对引物扩增出3.8条。
聚类分析结果表明（图3),37份胡萝卜材料可分为3类，其中，第1类包括A23，为地方品种，淡黄色；第2类包括A15和A17共2种，颜色分别为白色和橙色；第3类由绝大多数橙色材料和其他资源组成，可分为2个亚类，其中，第1亚类包括A1、A2、A3、A4、A7、A11、A8、A10、A34、A5、A6、A12、A37、A35和A36，除A2为紫色外其他都为橙色，第色A14、A18、A25。2亚类包括其他橙色资源，紫色A9、A16和A24。
3结论与讨论
在选育胡萝卜优良品种时，需要综合考虑地上部和地下部多个农艺性状指标[14,15,16]。本试验通过对37份胡萝卜种质资源27个性状的变异和多样性研究发现，9个数量性状中叶基盘宽度和肉质根单根质量变异系数较大，因此，可将胡萝卜叶基盘宽度和肉质根单根质量作为初选指标，而其他18个质量性状中11个性状的多样性指数均小于1，根肩绿色程度最大；进一步进行主成分分析，结果表明，单根质量和根长是影响胡萝卜遗传多样性的主要因子，研究结果与郑思宇等[17]对于青萝卜种质资源的农艺性状调查结果相似，说明在以肉质根为食用器官的根菜类中，地上部糖类等营养物质的供应与地下部储藏器官的膨大密切相关。
37份种质材料的基因型鉴定结果将供试胡萝卜种质资源分为3类，其中，第1类为淡黄色地方品种；第2类包括白色和橙色品种，说明白色和淡黄色胡萝卜的亲缘关系较远，由于白色和浅黄色是早期野生胡萝卜的2种类型[18]；第3类由绝大多数橙色材料、紫色和黄色资源组成，说明橙色、紫色和黄色材料之间亲缘关系较近，这与BANGA等[19]和IORIZZO等[20]提出的橙色胡萝卜可能由黄色栽培品种驯化而来的观点相符；同时紫色胡萝卜与橙色胡萝卜也聚在了一起，这与RONG等[21]的研究结果一致。
从本研究结果可以看出，表观型遗传距离的聚类结果与SSR标记遗传距离的聚类结果存在不一致性，这在其他植物上也有报道[22,23,24]。原因可能是由于一方面受生长环境影响，另一方面形态学观察需要一定的经验，且在统计过程中存在系统误差，使表型聚类结果和基因型鉴定结果存在差异。
种质资源的开发和利用需要掌握其遗传多样性和亲缘关系。本研究通过对37份胡萝卜种质的27个农艺性状进行田间调查，结果发现，单根质量和根长是影响其遗传多样性的主要因子；同时筛选得到43个SSR，对其亲缘关系的聚类分析结果表明，淡黄色地方品种齐头黄为一支，白色常规品种白玉萝卜和橙色常规品种拇指萝卜为一支，其余品种分为2个亚群聚为一支。通过主成分和聚类分析综合评价胡萝卜种质材料，将有助于指导亲本选配，可为促进胡萝卜研究和育种改良提供重要的种质资源和理论基础。
参考文献
[1] MA J,XU Z S,TAN G F,et al. Distinct transcription profile of genes involved in carotenoid biosynthesis among six different color carrot(Daucus carota L.)cultivars[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2017,49:817-826.
[2] MA J,LI J W,XU Z S,et al. Transcriptome profiling of genes involving in carotenoid biosynthesis and accumulation between leaf and root of carrot(Daucus carota L.)[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica,2018,50:481-490.
[3] 朱德蔚，方嘉禾，费砚良，等.中国农作物及其野生近缘植物多样性研究进展[J].植物遗传资源学报，2008,9(4):411-416.
[4] 赵彦，陈源闽，廉勇，等.胡萝卜种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].华北农学报，2007,22(4):137-140.
[5] 马振国，欧成刚，刘莉洁，等.胡萝卜品种资源遗传多样性及亲缘关系研究[J].中国蔬菜，2015(11):28-34.
[6] 赵斌，陈晓东，季昌好，等. 111份多棱大麦种质主要农艺性状的遗传多样性[J].大麦与谷类科学，2020,37(5):1-7.
[7] 张家榕，霍瑾，李贵全.大豆杂交后代群体产量与其相关农艺性状的综合分析[J].山西农业科学，2020,48(10):1579-1584.
[8] 宋芃垚.甜瓜遗传多样性分析及甜瓜黄绿叶片基因ygl的精细定位[D].郑州：河南农业大学，2017.
[9] 张亚飞.柑橘种质资源5个性状的多样性研究[D].重庆：西南大学，2020.
[10] 庄飞云，朱德蔚.胡萝卜种质资源描述规范和数据标准[M].北京：中国农业出版社，2007.
[11] 王述民，曹永生，胡家蓬，等.我国小豆种质资源形态多样性鉴定与分类研究[J].作物学报，2002(6):727-733.
[12] CAVAGNARO P F,CHUNG S M,MANIN S,et al. Microsatellite isolation and marker development in carrot genomic distribution,linkage mapping,genetic analysis and marker transferability across Apiaceae[J]. BMC Genomics,2011,12:386-407.
[13] 唐东明.聚类分析及其应用研究[D].成都：电子科技大学，2010.
[14] 王丰青，田云鹤，黄勇，等. 18个地黄种质的表型性状及相关统计学分析[J].植物资源与环境学报，2015,24(1):28-35.
[15] 邓晓辉，崔磊，甘彩霞，等.基于表型性状的湖北省萝卜资源的遗传多样性分析[J].湖北农业科学，2018,57(24):104-107.
[16] 徐靖，朱红林.海南本地甘薯种质资源农艺性状和营养品质比较[J].安徽农业科学，2020,48(1):46-48.
[17] 郑思宇，范伟强，王超楠，等.青萝卜种质资源主要农艺性状的表型评价[J].中国蔬菜，2020(9):50-56.
[18] SIMON P W,FREEMAN R E,VIEIRA J V,et al. VegetablesⅡ：Fabaceae,Liliaceae,Solanaceae,and Umbelliferae[M]. New York:Springer,2008:327-357.
[19] BANGA O. The development of the original European carrot material[J]. Euphytica,1957,6:64-76.
[20] IORIZZO M,DOUGLAS A S,SHELBY L E S,et al. Genetic structure and domestication of carrot(Daucus carota subsp. Stivus)(Apiaceae)[J]. American Journal of Botany,2013,1(5):930-938.
[21] RONG J,LANMERS Y,STRASBURG J L,et al. New insights into domestication of carrot from root transcriptome analyses[J]. BMC Genomics,2014,15:895-909.
[22] 蔡健，兰伟，李飞天，等.利用AFLP标记和形态性状检测皖北小麦主栽品种的遗传多样性[J].核农学报，2007(2):116-119.
[23] 冀小蕊，陈业渊，王静毅，等.香蕉引进品种遗传关系的微卫星检测[J].热带作物学报，2008(2):169-174.
[24] 姚锦爱，蔡鸿娇，石妞妞，等.香蕉种质资源亲缘关系的ISSR分析[J].福建农业学报，2012,27(1):37-42.
