氟广泛存在于地球上,是机体必需的微量元素之一,适量的氟有利于维持机体钙磷代谢和保持神经兴奋的传导。但过多摄入可导致肝肾等多种组织器官的广泛损伤。前期实验表明,过量氟化物导致大鼠肝细胞 DNA 损伤,并可诱导细胞凋亡,本研究观察氟化物对肝组织 caspase-3、caspase-9 基因表达水平,明确氟化物导致大鼠肝细胞 DNA 损伤并诱导细胞凋亡是否与 caspase-3、caspase-9 基因表达水平有关,进一步了解氟化物对肝组织损伤机制。
1、 材料与方法
1. 1 主要试剂和仪器
RNAiso Plus 总 RNA 提取试剂(TaKaRa 公司) 、5 × PrimeScript ? RT Master Mix 试剂盒(大连宝生物工程有限公司) 、反转录 SYBRPremix ? Ex TaqTMII 试剂盒 9 (大连宝生物工程有限公司 ) 、DNAMarker(大连宝生物工程有限公司) 、琼脂粉(西班牙) 、高速冷冻离心机 3 - 18K(美国 Sigma 公司) 、PTC - 200PCR 仪(美国 Bio - Rad 公司) 、ABI 7300全自动荧光定量 PCR(美国 ABI 公司) 、可调微量移液器(德国 eppendorf 公司) 。
1. 2 动物分组、肝系数测定及标本的采集
清洁级雄性 SD 大鼠 48 只,体重(100 ± 10) g,由山西医科大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(晋) 2009 - 0001。将 SD 大鼠观察 1 周适应环境后,随机分为 4 组,每组 12 只,各组均饲喂大鼠正常饲料,对照组、低氟组、中氟组和高氟组分别自由饮用含 0,50,100,200 ㎎/L 氟化钠去离子水。动物饲养于山西医科大学实验动物中心屏障环境[SYXK(晋) 2009 -0001],每月测定实验动物体重,观察体重变化,染毒 120 d。染毒结束,称量最后一次体重,麻醉后经右心灌注生理盐水,冲洗肝内血液,快速对大鼠的肝组织进行取材,用滤纸吸干表面血液,称重,测定肝系数[肝系数 = 肝质量(g) /体质量(g) × 100%]。将肝组织迅速放入液氮中速冻,然后转移至 - 80 ℃ 冰箱保存,以备实时荧光定量PCR 检测。
1. 3 肝组织中 caspase-3、caspase-9 基因表达的实时荧光定量 PCR 检测
称取低温冻结的肝组织 100 mg 加液氮研磨成粉末状,按 RNAiso Plus 试剂说明操作,提取总RNA,通过 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳进行肝组织总RNA 质量鉴定,核酸分析仪测量其浓度,用反转录试剂盒将其反转录为 cDNA。以 β-actin 作为内参照,caspase-3 上游引物: 5’- AGCCATGTACGTAGC-CATCC - 3’,下游引物: 5’- GGCGCAAAGTGACTG-GATGA - 3’,产物长度 147 bp; caspase-9 上游引物:5’- CTGAGCCAGATGCTGTCCCATA- 3’,下游引物:5’- GACACCATCCAAGGTCTCGATGTA- 3’,产物长度 176 bp; β- actin 上游引物: 5’-AGCCATGTACG-TAGCCATCC- 3’,下游引物: 5’- ACCCTCATAGAT-GGGCACAG- 3’,产物长度 115 bp。然后进行扩增:95 ℃ 30 s; 然后 95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40 个循环,添加溶解曲线,反应结束后,电脑自动输出溶解曲线及对应 Q 值(达到阈值循环数) 和扩增曲线。取 6 μlPCR 产物经 2% 琼脂糖进行凝胶电泳,采用凝胶成像系统观察,以进行 PCR 产物鉴定。
1. 4 实验数据处理及分析
相对表达量比较采用 2- ΔΔCt法分析,表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。ΔCt(染氟组) = Ct(目的基因) - Ct(内参基因) ; ΔCt(对照组) = Ct(目的基因) - Ct(内参基因) ; ΔΔCt =ΔCt(染氟组) - ΔCt(对照组) 。目的基因的相对表达水平 =2- ΔΔCt。
样品的阈值线设置相同,采用 SPSS13. 0 统计软件计算重复样品间 Ct 均值及标准偏差,应用 2- ΔΔCt法处理数据。
1. 5 统计学分析
实验数据采用 SPSS 16. 0 统计软件进行分析,组间比较采用单因素方差分析及 LSD - t 法检验。
2、 结果
2. 1 不同染氟时期大鼠的体重变化
从表 1 可知,染氟过程中各组大鼠生长发育良好,体重均明显增加。经统计分析,不同时期各染氟组体重与相应的对照组相比,差异无统计学意义,各染氟组之间体重两两比较差异也无统计学意义。
2. 2 氟对各组大鼠肝脏脏器系数的影响
从表 2 可知,染氟组大鼠肝脏脏器系数与对照组相比,差异无统计学意义; 各染氟组间比较差异也无统计学意义。
2. 3 肝脏组织总 RNA 的浓度和纯度
大鼠肝脏 RNA 经提取纯化后,在 1. 0% 琼脂糖凝胶电泳进行快速分析(15 V/cm) ,从图可以看出,总 RNA 有明显三条带(5S,18S 和 28S) ,表明总RNA 的完整性较好,基本无降解。SD 大鼠肝组织总 RNA,吸光度 A260/ A280均在 1. 8 - 2. 0 之间,表明总 RNA 的纯度达到了实验要求(见图 1) 。
2. 4 样品扩增动力学曲线和溶解曲线分析
实验组与对照组 SYBR GreenⅠ荧光定量 PCR溶解曲线所得的 caspase-3、caspase-9 扩增时的 Tm值非常均匀,并且峰值单一(见图 2) ,说明没有引物二聚体和非特异性条带形成。由扩增曲线看出扩增曲线间距非常均一,平行性较好(见图 2) ,说明目的基因与内参基因扩增效率一致,符合在不制作标准曲线的情况下进行相对定量的条件。
2. 5 目的基因 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶水平电泳检测
目的基因 PCR 扩增后,琼脂糖凝胶电泳得caspase-3、caspase-9、β - actin 片段分别为 147 bp、176 bp、115 bp,确定为所需要的目的基因
。
2. 6 氟对大鼠肝脏 caspase-3 基因和 caspase-9 基因表达的影响
相对定量分析表明,氟诱导大鼠肝脏细胞损伤,引起了 caspase-3 和 caspase-9 基因表达水平的改变(见表 3) ,低、中、高剂量组 caspase - 3 基因表达量分别是对照组的 0. 34 ±0. 10、1. 37 ±0. 43 和2. 27 ±0. 73 倍,其中高氟组表达显著增高 (P < 0. 05 ) ;caspase-9 的基因表达量分别是对照组的 1. 03 ±0. 36、3. 05 ± 0. 68 和 5. 85 ± 0. 52倍,中氟组和高氟组表达显著高于对照组(P <0. 05) 。
3、 讨论
caspase 属于半胱氨酸蛋白酶家族,其家族成员大部分是凋亡的启动子或效应子,在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。目前研究者发现的有 15 种caspase,根据 caspase 在级联反应的上、下游所处位置和其功能的不同,把它分为三大类,第一类为凋亡始动子,它位于级联反应的上游,它们是包括caspase-2、caspase-8、caspase-9 等,能在其他蛋白参与下发生自我活化并激活下游的 caspase。第二类是凋亡效应子,它位于级联反应的下游,分别是caspase-3、caspase-6、caspase-7,它们能被上游的始动子激活,而激活后的 caspase 作用于那些特异性底物上,使细胞发生形态学及生化等改变,最终导致细胞凋亡等其他改变。第三类包括 caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-13、caspase-14,此类 caspase 在细胞因子介导炎症反应中发挥着主要作用,其次还在死亡受体介导的细胞凋亡途径中起到辅助作用。
有研究表明,caspase 酶原可以通过以下几种方式激活: 自活化(autoactivation) 、转活化(transactiva-tion) 和非 caspase 蛋白酶活化 (activation by non -caspase proteinases) ; caspase 酶原在某种条件下有自活化的潜能,比如这种酶原在高浓度时可以自活化,把 caspase-2 的原域和 caspase-3 酶原融合起来,大大增强了酶原的自活化和 caspase-3 诱导的凋亡。caspase-9 能激活酶原 caspase-3 和 caspase-7,但不能激活 caspase-6,caspase-3 反过来可以再激活 caspase-9 及 caspase-8,这样形成正反馈,即活化的 caspase-9 激活 caspase-3和 caspase-7,活化的caspase-3 反过来又能激活 caspase-9 酶原,形成正反馈通路。
本实验采用实时荧光定量 PCR 技术对肝组织caspase-3 mRNA 和 caspase-9 mRNA 表达进行检测发现,氟诱导大鼠肝脏细胞凋亡以及对肝细胞 DNA损伤的同时,引起了 caspase-3 和 caspase-9 mRNA 表达水平的增高,低剂量的氟对 caspase-3 mRNA 表达量较 caspase-9 mRNA 影响不显著,中、高剂量的氟对 caspase-3 mRNA 和 caspase-9 mRNA 表达影响均很明显,呈上升趋势,特别是中、高剂量组的caspase-9 mRNA 表达量分别是对照组的 3. 05 ± 0.68、5. 85 ± 0. 52 倍。通过检测大鼠体重及肝脏脏器系数,染氟组与对照组相比,体重及肝脏脏器系数差异均无统计学意义,说明氟对体重及脏器系数无明显影响,可能是因为大鼠首次接触外来物质需要一个适应过程,氟在该过程中对机体体重及脏器系数的影响可能未显示出来。
综上所述,氟引起的 caspase-3 mRNA 和caspase-9 mRNA 表达较对照组增高,高剂量组caspase-3 mRNA 和 caspase-9 mRNA 表达较中剂量组增 高,中、高剂量的氟对 caspase-3 mRNA 和caspase-9 mRNA 表达影响更大。根据以上实验结果可以发现,低剂量氟进入大鼠肝组织内后,并不一定能立刻激活 caspase-9,随着氟剂量的增大和染氟时间的延长,氟有可能引起一系列肝组织细胞因子的改变,激活 caspase-9,进而激活 caspase-3 最终导致肝组织细胞的损伤。由此推测氟对肝细胞 DNA损伤以及诱导细胞的凋亡,可能是通过激活caspase-3 和 caspase-9 而促进了细胞 DNA 损伤和凋亡的发生,当然,氟对大鼠肝组织的损伤作用及机制复杂,还有待更进一步探索。
参考文献:
[1] 黄德远,王丹,张秀慧,等. 高摄吕燃煤型氟中毒大鼠肝损伤干预效果分析[J]. 中国公共卫生,2010,6(3) : 290 -291.
