支气管哮喘是气道对非特异性刺激高反应应答的一种慢性炎症性疾病,过敏原的吸入引起双相的、可逆的气流阻塞。气道重塑是哮喘的重要病理特征,气道重塑的发生不仅出现在哮喘的晚期,而且出现在哮喘的早期,并呈持续性进行性加重。神经生长因子(NGF)属于神经营养因子家族成员,在肺组织内的多种结构细胞和炎性细胞均有表达,有研究结果表明,NGF可能参与哮喘气道炎症、高反应性及气道重塑。胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)能诱导成纤维细胞及气道平滑肌增生,并抑制其凋亡,并促进细胞间黏附因子-Ⅰ(ICAM-Ⅰ)的表达,加重气道炎症反应。本文制备大鼠慢性哮喘模型,观察应用地塞米松(激素)后气道平滑肌厚度、细胞核数、NGF、IGF-Ⅰ表达的变化,了解其对气道重塑的影响和可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
清洁级雄性Wistar大鼠30只,体质量(120±20)g,先在实验条件下观察2d,无异常情况出现即开始用于实验。随机分为正常对照组、哮喘模型组、激素干预组,每组10只。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的制备参照文献方法并进行改良:于第1、8天分别给予哮喘模型组和激素干预组大鼠腹腔内注射抗原液(含有卵蛋白1mg,氢氧化铝100mg)1mL致敏。第15天开始使用超声雾化器向雾化吸入箱内喷雾10g/L卵蛋白,每次持续30min激发哮喘,隔日1次,大鼠连续吸入12周。激素干预组在每次激发前30min腹腔注射地塞米松0.5mg/kg。抗原激发后,以大鼠出现头、面部瘙痒,呼吸加深、加快,少动、弓背,严重者呼吸减慢或节律不整、轻度发绀、四肢无力、反应迟钝等为激发成功的标志。正常对照组以生理盐水代替抗原液、雾化吸入的激发液及腹部注射的地塞米松。
1.2.2 取材与染色方法各组大鼠分别于末次激发后立即用10g/L戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)麻醉,消毒开腹,腹主动脉采集动脉血进行血气分析,以血气结果作为哮喘严重程度的评定指标。
然后暴露胸腔,分离气管,插入套管针,结扎右主支气管,用生理盐水10mL分3次灌洗左肺(第1次用3mL,第2次用3mL,第3次用4mL,每次在肺内停留约30s),回收液体,收集回收率高于80%的肺泡灌洗液(BALF),以2 000r/min离心15min,取上清液及细胞沉淀物分装,行细胞总数及细胞分类计数。再经右心室插管至肺动脉,用生理盐水快速冲洗后,取右肺中叶,置于40g/L甲醛中固定,常规石蜡包埋切片,行苏木精-伊红染色(HE染色)及免疫组化染色(SABC)。
1.2.3 气道壁平滑肌厚度及炎性细胞浸润观察HE染色切片在显微镜下放大100倍,选择横断面完整的同级别支气管,测量呼吸道壁平滑肌厚度和支气管平滑肌细胞核数。用光笔描绘出呼吸道基底膜周长及平滑肌内外边界间宽度,平滑肌厚度(μm)为呼吸道基膜周长/平滑肌内外边界间宽度。
1.2.4 NGF和IGF-Ⅰ表达测定SABC切片在高倍镜下(400倍)观察,应用IPP图像分析软件测定阳性表达区单位面积吸光度(A)值。
1.3 统计学方法
应用SPSS 17.0软件进行统计分析,计量资料以x珚±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组哮喘发作情况
实验选用大鼠30只,脱落3只,进入结果分析27只,其中正常对照组10只,哮喘模型组8只,激素干预组9只。正常对照组大鼠吸入生理盐水后无明显反应,肺部听诊无干湿性啰音;哮喘模型组和激素干预组在第3次雾化吸入卵蛋白后,大部分出现哮喘发作,表现为呼吸加深加快、口唇发绀、面部瘙痒、四肢无力、行动迟缓等,肺部听诊可闻及明显哮鸣音;激素干预组雾化吸入卵蛋白后,哮喘发作症状较哮喘模型组逐渐减轻,第6次应用激素后已无明显症状,肺部听诊可闻及少许哮鸣音。各组大鼠动脉血气分析显示,哮喘模型组、激素干预组二氧化碳分压(PaCO2)明显高于正常对照组,氧分压(PaO2)明显低于正常对照组(F=16.21、81.57,q=3.57~7.93,P<0.05);激素干预组大鼠与哮喘模型组比较PaCO2下降,PaO2升高(q=4.12~8.16,P<0.05)。见表1。【表1】
2.2 各组肺组织病理改变比较
HE染色显微镜下观察显示,哮喘模型组肺组织结构轻度破坏,支气管及血管周围大量的炎性细胞浸润,黏膜下水肿,黏膜褶皱增多,支气管壁明显增厚且不规则,支气管平滑肌肥厚,管腔狭窄,胶原沉积;激素干预组大鼠肺组织支气管上皮细胞的炎症反应较哮喘模型组轻,支气管壁及管腔内的炎症细胞也较哮喘模型组大为减少;正常对照组大鼠肺组织结构正常,肺泡腔内有个别炎症细胞渗出,支气管平滑肌未见增厚。
2.3 各组大鼠 NGF和IGF-Ⅰ表达比较
NGF和IGF-Ⅰ主要表达在气道上皮细胞的胞浆中,均为黄褐色颗粒状物。哮喘模型组、激素干预组大鼠气道壁组织NGF、IGF-Ⅰ表达及气道平滑肌厚度和平滑肌细胞核数均 明显 高 于 正 常 对 照 组(F=60.19~284.63,q=6.57~15.93,P<0.05),激素干预组上述指标结果明显低于哮喘模型组(q=5.23~9.15,P<0.05)。见表2。
2.4 各组大鼠 BALF总细胞计数及细胞分类计数比较
各组大鼠BALF的细胞分类均主要为淋巴细胞,其次为单核细胞和中性粒细胞;正常对照组和激素干预组几乎未见嗜酸性粒细胞,哮喘模型组可见少许。哮喘模型组、激素干预组BALF细胞总数及各种细胞计数均显著高于正常对照组(F=10.69~554.12,q=3.41~23.43,P<0.05),而激素干预组明显低于哮喘模型组(q=2.12~8.13,P<0.05)。见表3。
2.5 指标之间的相关性分析
哮喘模型组大鼠气道壁中NGF、IGF-Ⅰ表达与气道壁平滑肌厚度呈正相关(r=0.473、0.819,P<0.05),与BALF细胞总数和淋巴细胞数呈正相关(r=0.603~0.783,P<0.01)。【表2-3】
3 讨论
本实验参照文献采用卵蛋白雾化吸入的方法制备动物哮喘模型,此方法应用时间长,技术相对成熟。结果表明,大鼠的外观表现、肺组织及支气管病理改变符合人类哮喘的病理表现;血气分析显示,哮喘模型组大鼠存在低氧血症和二氧化碳潴留,间接表明大鼠存在通气功能障碍,肺部听诊可闻及明显的哮鸣音,提示哮喘模型制备是成功的。
NGF是调节神经元发育,维持和修复损伤神经元的神经营养蛋白家族的一个成员。除了神经营养活性,NGF已被报道具有更广泛的非神经元细胞的生物活性,比如参与整合刺激自适系统的成熟和表达。有研究显示,表达于肺组织的NGF能够增强T细胞和B细胞介导的免疫应答,诱导淋巴细胞分化和肥大细胞的增殖,促进嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞从外周祖细胞的分化。本文结果显示,哮喘模型组大鼠NGF的表达与BALF的炎症细胞总数和淋巴细胞数均呈正相关,与VIRCHOW等的结果相符;而哮喘是主要由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞等多种炎症细胞参与的慢性气道炎症,提示气道内NGF的表达可能通过多种炎症细胞的增殖、分化参与哮喘的发生与发展。
除了神经细胞和炎症细胞,气道结构细胞也可能是NGF的靶细胞。有研究显示,NGF能诱导人类肺成纤维细胞、血管平滑肌细胞收缩和迁移,还能导致内皮细胞增生。血管内皮生长因子(VEGF)能够促进呼吸道平滑肌增生和血管生成,NGF能够增加VEGF的释放,间接促进血管产生和平滑肌的增生。本文结果显示,哮喘模型组支气管平滑肌厚度和细胞数目明显增加,血管增生,提示发生气道重塑改变,NGF的表达与气道壁平滑肌厚度呈正相关,与文献结果相符,表明NGF的表达增强在气道重塑中起着重要的作用。本文哮喘模型组、激素干预组NGF的表达及平滑肌厚度均高于正常对照组,激素干预组低于哮喘模型组,表明糖皮质激素通过作用于肺内结构细胞中NGF的表达,抑制气道重塑,但抑制作用并不完全。
IGF是一类多功能细胞增殖调控因子,具有种系稳定性,气道上皮、腺体、肺成纤维细胞、巨噬细胞等均能合成和分泌,能够通过促进ICAM-1的表达,使黏附于毛细血管内的炎症细胞渗出,加重气道炎症。有研究表明,通过调节IGF-Ⅰ的浓度及其刺激过程可使气道上皮细胞的生长达到最佳状态,提示IGF-Ⅰ参与气道上皮细胞的增生。本实验结果显示,哮喘模型组大鼠IGF-Ⅰ表达显著高于正常对照组,平滑肌厚度及细胞核数明显高于正常对照组,炎性细胞浸润明显,IGF-Ⅰ表达水平与气道壁厚度及BALF细胞总数呈明显正相关,表明IGF-Ⅰ通过调控气道上皮细胞的增殖、炎性细胞的渗出在气道重建及炎症反应中起一定作用。其作用机制可能与IGF能与促炎症类花生白三烯D4(LTD4)协同促进气道平滑肌细胞(ASM)的有丝分裂有关。
研究已经证实,IGF-Ⅰ能在没有其他生长因素的前提下刺激各种类型细胞的增殖,具有较强的抗凋亡作用。本文激素干预组IGF-Ⅰ和平滑肌厚度较哮喘模型组下降,炎症细胞有所减少,与杨敏等和HOSHINO等研究结果相符,表明吸入糖皮质激素能够降低哮喘大鼠气道IGF-Ⅰ的表达和气道壁厚度,抑制气道炎性细胞浸润,阻止气道重建;而激素干预组各项指标均高于正常对照组,说明单纯使用糖皮质激素并不能完全抑制哮喘气道炎症及重塑进展,具体机制尚需进一步研究。
综上所述,NGF和IGF-Ⅰ表达影响哮喘病人气道重塑和炎症反应,应用糖皮质激素可部分抑制其作用,但具体机制尚待进一步研究。
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