建立对多种病毒的快速、高通量、低成本的分子检测方法，对保障养殖鱼类健康、防止疾病发生具有重要的意义。淋巴囊肿病毒（lymphocystisdisease virus,LCDV）、大菱鲆红体病虹彩病毒（turbot reddish body iridovirus,TRBIV）、 细 胞肿大病毒属虹彩病毒（Megalocytivirus,Mega）、赤点石斑鱼神经坏死病毒（red-spotted grouper ner-vous necrosis virus,RGNNV）、传染性造血器官坏死病毒（infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV）、传染性胰脏坏死病毒（infectious pancre-atic necrosis virus,IPNV）、病毒性出血败血症病毒（viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV）、传染性鲑鱼贫血病毒（infectious salmon anaemia vi-rus,ISAV）是养殖鱼类主要的病毒性病原，均能引起传染性、暴发性疾病。国内外关于这些病毒的毒力基因分析以及分子检测已有较多的文献报道。
其中 LCDV、TRBIV、Mega 和 RGNNV 都含有衣壳蛋白（CP），在病毒颗粒中负责包被病毒核酸和核酸 - 蛋白质复合体，由于不同病毒的 CP 基因序列相似性较低，因此该基因可用于这些病毒的特异性鉴定[1-3].核蛋白基因（N）是 IHNV 的主要毒力基因之一，通常被用于 IHNV 的分子鉴定以及其毒性强弱的判断[4].VP5 是 IPNV 的主要毒力基因之一，因此 VP5 基因可作为检测 IPNV 的生物学标记[5].糖蛋白基因（G）是 VHSV 的主要毒力基因之一，常被用于 VHSV 的分子鉴定以及其毒性强弱的判断[6].核蛋白 NS、基质蛋白 MA 是ISAV 的主要毒力基因，因此 NS、MA 基因可作为检测 ISAV 的生物学标记[7].
基因芯片作为生物芯片的一种，最初是在 20世纪 80 年代初由 Bains W. 等人提出的概念。目前是在生命科学领域应用的最为广泛也最为成熟的一种对大量的遗传信息进行高效、快速的检测和分析的方法。在表达谱的构建[8]、筛选相关基因[9]、临床诊断上都有广泛的研究和应用[10].基因芯片在临床医学检测上的应用已有相关的报道，但在鱼类病毒的检测方面研究很少。本研究针对上述鱼类病毒，建立了基因芯片检测方法，对其反应参数进行优化并进行了初步应用，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 含病毒基因的克隆质粒。含有 LCDV、T R B I V 、 M e g a 、 R G N N V 、 I H N V 、 I P N V 、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA 相关基因的 T-A 克隆质粒和菌株均由本实验室构建，用作基因芯片检测的阳性模板（各基因的 GenBank 检索号见表 1）。
1.1.2 主要试剂、耗材。实验中所用到的 Trans-StartTMTop Taq DNA Polymerase、High Pure dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司，海洋动物组织基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，质粒小量快速提取试剂盒购自博迈德生物，氨基、醛基修饰片基购自博奥生物。
1.2 方法
1.2.1 病毒基因阳性模板的制备。分别将含有 LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA 等 病 毒 相 关基因的克隆菌株过夜培养。对扩大培养的菌液提取质粒，用超微量核酸蛋白测定仪（美国 Nano-Drop2000）测定核酸的浓度和纯度，保存于 -20 ?C备用。
1.2.2 基因芯片探针的设计。各病毒探针的设计方法是：依据病毒特异性的基因序列，使用 Al-leleID 7.0 软件设计寡核苷酸探针（25 ~ 30 mer），使其分别与病毒的 CP、N、VP5、G、NS、MA 等基因位点互补。此外，在各探针 5′端连上一段长度为 15 mer 的 poly（dT）作为间隔臂，以减少探针与片基之间的空间位阻，提高其杂交效率（检测各鱼类病毒的探针序列见表 1）。
本研究还设计了基因芯片的 3 套质控探针，即表面化学质控探针、阳性对照探针、阴性对照探针。
表面化学质控探针（QC-1）：随机 ' 写出一段寡核苷酸序列（5'-ACAAGGGATATCGCTGGGT-3'），该序列不产生稳定的二级结构，与病原基因序列也没有同源性。阳性对照探针（QC-2）：根据牛的β- 珠蛋白基因（HBB）设计扩增引物和阳性对照探针，扩增得到的标记产物与阳性对照探针杂交产生阳性信号。阴性对照探针（QC-3）：根据牛的β- 珠蛋白基因（HBB）进行阴性探针的设计。另外设置一套空白对照（QC-4），即以 ddH2O 代替探针点样。
1.2.3 基因芯片和 Cy3 标记产物的制备。芯片制备：将各探针以 50% DMSO 稀释至 20 μmol/L,操作 PersonalArrayer 16 个人点样仪点样于醛基修饰玻片，每种探针并排点 3 份，即设置 3 个平行。将玻片置于湿盒中室温放置 4 h,0.5% SDS 清洗10 min,超纯水洗涤 2 min,离心后 4℃保存。采用多重 PCR 技术对鱼类病毒的相关基因片段进行扩增，并对扩增产物进行同步 Cy3 标记。
1.2.4 杂交体系组成。杂交体系总体积 15 μL:含 100% 甲 酰 胺 3.75 μL,20×SSC 2.25 μL,10% SDS 0.3 μL,50×Denhardt's 1.5 μL,Cy3标记产物 7.2 μL.
1.2.5 氨基片基和醛基片基对比。氨基片基探针的固定：将未修饰的 LCDV、RGNNV 探针以 50%DMSO 稀释至 20 μmol/L,点样后将玻片置于80?C 烘箱 80 min,浸入超纯水中 1 min,再迅速浸入 -20 ?C 无水乙醇中 1 min,超纯水清洗 2 min,离心后 4 ?C 保存。醛基片基探针的固定：将 5′端带有氨基修饰的 LCDV、RGNNV 探针按 1.2.3 制备流程进行探针的固定。最后取 LCDV、RGNNV的 Cy3 标记产物按 1.2.4 配制成杂交液与基因芯片进行杂交、清洗和扫描，分析结果。
1.2.6 不 同 探 针点样液的对比。 取 LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV 氨基修饰的探针，分别用50% DMSO、3×SSC 和 ddH2O 稀释至 20 μmol/L,进行醛基片基点样。取等量 LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV 的 Cy3 标记产物，按 1.2.4 配制杂交液，进行杂交、清洗，最后用LuxScan 10K扫描仪扫描，分析结果。
1.2.7 芯片杂交探针浓度的优化。取 LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV 的氨基修饰探针以 50%DMSO 分别稀释成 20、15、10、5 μmol/L,进行醛基片基点样。取等量 LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV 的 Cy3 标记产物，按 1.2.4 配制杂交液，进行杂交、清洗和扫描，分析结果。
1.2.8 芯片杂交温度的优化。取 LCDV、RGN-NV、IHNV、IPNV 的氨基修饰探针点样，取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV 的 Cy3 标记产物，按1.2.4配制交体系，每次取一张基因芯片进行杂交，每次的杂交温度分别设定为 37 ?C、42 ?C、47 ?C、52 ?C、57 ?C,最终清洗、扫描，分析结果。
1.2.9 芯片杂交时间的优化。取 LCDV、RGN-NV、IHNV、IPNV 的氨基修饰探针点样，取等量LCDV、RGNNV、IHNV、IPNV 的 Cy3 标记产物，按 1.2.4 配制杂交体系，取四张芯片进行杂交，杂交过程中每隔 0.5 h 取出一张芯片进行清洗，最终进行芯片的扫描，分析结果。
1.2.10 优化后芯片的整体杂交效果。根据上述优化得到的最佳反应参数，对 LCDV、TRBIV、Mega、RGNNV、IHNV、IPNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA 进行 Cy3 标记产物的制备、与芯片进行杂交、清洗和扫描，评价杂交效果。
1.2.11 基因芯片对病鱼样品的检测。取患病鱼的脑、脾、肾等组织，分别提取 DNA 和 RNA.对DNA 和反转录生成的 cDNA 进行多重 PCR 扩增，制备 Cy3 标记产物。将扩增产物按照 1.2.10 所述进行基因芯片检测，分析检测结果。同时使用常规PCR 方法进行病毒检测，作为对比。
2 结果与分析
2.1 氨基片基与醛基片基的杂交效果对比
醛基片基的点样结果与氨基片基相比，点阵更加均一，杂交信号强度明显高于氨基片基（图 1）。表明醛基片基的探针结合能力更强，因此本研究选用醛基片基进行基因芯片的制备。
2.2 不同点样液的对比
通过对不同点样液制备的芯片进行杂交、清洗及扫描，结果显示：50% DMSO 效果最好，该点样液的点圆润均一，杂交信号最强；而 3 × SSC作为点样液杂交信号强度较弱，且部分点出现扩散、大小不均一的情况；ddH2O 作为点样液的杂交结果几乎看不到信号（图 2）。因此选用 50 % DMSO作为基因芯片制备的点样液。
2.3 芯片杂交探针浓度的优化
通过对不同浓度探针制备的芯片进行杂交、清洗及扫描，结果显示：随着探针浓度的逐渐降低，杂交信号强度与杂交信号均值大致呈下降趋势。由于各探针的点样均一程度等问题，个别杂交点出现了低浓度探针杂交信号高于高浓度探针杂交信号的情况（图 3）。综合比较，探针终浓度为 20 μmol/L 时杂交效果最好，因此选用该浓度的探针用于基因芯片的检测。
2.4 杂交温度的优化
当杂交温度为 37 ?C、42 ?C、47 ?C 时，样品的荧光信号均清晰可见。随着温度的升高，信号强度也相应增强，在 47 ?C 时达到最强。当杂交温度升高至 52 ?C 时，信号强度急剧下降。其中LCDV和 RGNNV 的信号强度很弱；当杂交温度升高至57 ?C 时，IHNV 和 IPNV 的信号强度也变得很弱（图4）。因此最终选择 47 ?C 作为基因芯片的最佳杂交温度。
2.5 杂交时间的优化
当杂交时间为 0.5 h 时，几乎看不到样品的荧光信号；杂交 1.0 h 后，荧光信号有所增强。随着杂交时间延长至 1.5 h 时，荧光信号强度也达到了峰值。继续延长杂交时间至 2.0 h 时，荧光信号强度并无明显增加（图 5）。综合考虑，选用 1.5 h作为基因芯片的最佳杂交时间。
2.6 参数优化后的基因芯片杂交效果
制备鱼类病毒相关基因Cy3标记产物之后，应用上述优化后的反应参数，进行基因芯片的杂交。结果显示：病毒探针均能与对应的Cy3标记产物杂交，并产生均匀的荧光信号，整体杂交效果非常理想（图6）。
2.7 对病鱼样品的检测结果
在对病鱼样品的实际检测中，该基因芯片对本实验室收集到的 19 份样品的检测结果为：养成期牙鲆中检出 LCDV 的感染，养成期大菱鲆中检出TRBIV 的感染，在半滑舌鳎鱼苗中检出 RGNNV的感染，在石斑鱼中检出细胞肿大属（Mega）病毒（图 7）。该检测结果与使用常规 PCR 的检测结果完全一致。
3 讨论
在鱼类的养殖过程中，多种病毒病的发生往往会带来巨大的经济损失，严重影响了养殖业的健康、可持续发展，因此研发快速、可靠、高通量的病毒检测方法具有重要价值。生物芯片技术已被广泛应用在基因工程和临床医学等领域[9,11],在水产方面的研究和应用也日益增多，比如在水母分型及进化地位[12]、贝类致病性弧菌[13]、对虾致病菌[14]、鱼类病原菌[15-16]等方面，但在鱼类病毒方面的研究和应用却很少。本研究建立了基因芯片技术检测鱼类病毒的方法，优化了反应参数，得到了稳定、清晰的杂交结果，并在鱼类病毒检测中的进行了初步应用。
本研究建立的基因芯片检测技术能够在一个微阵列中与 7 种病毒 10 个基因的标记扩增产物同时进行杂交，并得到理想的杂交效果，这在很大程度上提高了重要海水养殖鱼类病原筛查工作的效率，与已报道的仅能同时检测 2 种鱼类病毒的基因芯片相比具有明显的优势[17].在探针设计方面，本研究在每条探针的 5' 端连上一段长度为 15mer 的 poly（dT）作为间隔臂，从而有效地降低了探针与片基间的空间位阻，提高了标记产物与其杂交的效率。总之，本研究建立的基因芯片检测鱼类病毒的方法，具有通量高、特异性强的优势，为鱼类的多病原检测及流行病调查提供了快速、有效的工具，对保障养殖鱼类健康、防治疾病发生具有重要的意义。
本研究的不足之处是对建立并优化的基因芯片方法应用不足，今后需要使用更多的样品对该基因芯片进行验证和测试，以便持续改进。
参考文献：
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