布尼亚病毒科包括约350种RNA病毒,主要分布在5个病毒属,即汉坦病毒属、内罗病毒属、正布尼亚病毒属、白蛉病毒属和番茄斑萎病毒属。除番茄斑萎病毒属外,其余病毒属均包含可感染脊椎动物和人类的病毒。据文献报道,多种白蛉病毒可感染人类,引起从自限性疾病到致死性出血热等不同程度的后果。
在布尼亚病毒科病毒血清学诊断方面,ELISA方法简单快捷,敏感性和特异性均较高,可检测抗原及抗体,是常用的实验室诊断方法。但是由于其受血清学交叉反应的限制,只有部分病毒基于重组核蛋白抗原的实验室诊断方法被建立起来,却极少有商业化的ELISA试剂盒问世。本实验选取立夫特谷热病毒(Rift valley fever virus,RVFV)、发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with throm-bocytopenia syndrome virus,SFTSV)、哈特兰德病毒(Heratland virus,HLV)、乌库病毒(Uukuniemivirus,UUKV)、那不勒斯白蛉热病毒(Sandfly fe-ver naples virus,SFNV)及西西里白蛉热病毒(Sandfly fever sicilian virus,SFSV)共六种致病性白蛉病毒,以探究其核蛋白的抗原性和免疫反应性,并进行血清学反应比较研究,旨在为研发相应的血清学诊断试剂及避免因血清学交叉反应而导致的误判误诊提供有效依据。
材料与方法
1、 材料
Vero细胞购自美国ATCC,本科室传代保存;SFTSV分离自病人血清,本科室传代保存;HLV由美国疾病预防控制中心提供,本科室传代保存;UUKV、SFNV及SFSV由美国疾病预防控制中心提供病毒上清裂解液,本科室保存。RVFV核蛋白基因由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
兔 抗-RVFV-NP、SFTSV-NP、HLV-NP、UUKV-NP、SFNV-NP和SFSV-NP多克隆抗体通过原核系统表达纯化的相应病毒核蛋白免疫新西兰白兔制备。辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔IgG抗体及抗人IgG抗体,碱性磷酸酶(AP)标记的抗兔IgG抗体均购自于美国sigma公司。
2、六种白蛉病毒核蛋白的表达及纯化
将上述六种病毒NP编码基因分别克隆至pET30a载体,并转化入BL21(DE3)感受态细胞,均匀涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的固体LB培养基,37℃过夜培养后挑选出正确的克隆并接种至含50μg/mL卡那霉素抗性的2xYT培养基,37℃培养至OD值达到0.6后加入IPTG至终浓度为1mM,30℃过夜培养。收获细胞并将之重悬于结合缓冲液(20mMTris,500mM NaCl,pH7.5),超声破碎后离心,上清经0.45μm滤膜过滤后通过金属镍离子螯合层析纯化,目的蛋白用洗脱缓冲液(20mM Tris,500mMNaCl,500mM Imidazole,pH7.5)洗 脱收集并于PBS缓 液中透析。纯化的六种病毒核蛋白经SDS-PAGE鉴定后分装冻存于-80℃。
3、间接ELISA方法检测六种白蛉病毒核蛋白抗原性
纯化的六种白蛉病毒核蛋白分别以每孔500ng包被96孔ELISA板,六种兔免疫血清和阴性对照兔免疫血清均以1∶500起两倍稀释至1∶1 024 000后分别加入包被反应板中,而五份SFTSV病人的血清和一份正常人的血清均以1∶100起两倍稀释至1∶204 800后分别加入另外的包被反应板中,稀释后的血清均以100μl/孔 加 入,37℃温育1h。
PBST洗板后加入相应检测抗体:HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1∶3 000稀释)和羊抗人IgG抗体(1∶1 000稀释),37℃温育1h;PBST洗板后加TMB显色,酶标仪测定反应板中每孔液体450nm处的吸光度值(A450)。吸光度值大于阴性对照的2.1倍判断为阳性。
4、 Western-blotting方法检测六种白蛉病毒核蛋白抗原性
将六种白蛉病毒重组核蛋白抗原和阴性对照EV71-VP1抗原进行SDS-PAGE,恒压20V转膜后用封闭缓冲液(5%脱脂奶,PBS)室温封闭1h后,分别加入六种重组核蛋白抗原的兔免疫血清(1∶1 000稀释),室温反应1h后4℃过夜。PBST洗膜后加入AP标记的抗兔IgG抗体(1∶2 000稀释),室温反 应1h,PBST洗膜后加入显色剂 (BCIP/NBT)显色。
结果
1、六种白蛉病毒核蛋白的表达与纯化
表达六种白蛉病毒核蛋白的菌液经收集超声后,上清与沉淀分别进行SDS-PAGE检测,结果显示目的蛋白多存于上清中,说明目的蛋白均为可溶性。纯化后的六种白蛉病毒核蛋白经SDS-PAGE鉴定,均呈现单一的蛋白条带,纯度达到90%以上,相对分子量RVFV-NP为26kD,SFTSV-NP为27kD,HLV-NP为26kD,UUKV-NP为28kD,SFNV-NP为28kD,SFSV-NP为28kD。结果如图1所示。
2、间接ELISA方法检测六种白蛉病毒核蛋白抗原性
六种白蛉病毒重组核蛋白抗原兔免疫血清和阴性对照兔免疫血清均以1∶500起两倍系列稀释至1∶1 024 000,结果显示每种病毒核蛋白抗原兔免疫血清IgG抗体滴度都能达到1∶512 000或以上。
同时,每种病毒核蛋白抗原兔免疫血清都与其余五种白蛉病毒重组核蛋白抗原存在交叉反应,交叉反应的ELISA滴度从1∶2 000到1∶128 000不等,而六种白蛉病毒核蛋白抗原与阴性对照兔免疫血清均无交叉反应。五份SFTSV病人血清和一份正常人血清均以1∶100起两倍系列稀释至1∶204 800,结果显示这5份病人血清IgG抗体滴度都能达到1∶12 800,并且1号、2号、3号病人血清分别可与其它1种至4种不等的白蛉病毒重组核蛋白抗原存在交叉反应。而六种白蛉病毒核蛋白抗原与正常人血清均无交叉反应。结果如表1所示。
3、 Western-blotting方法检测六种白蛉病毒核蛋白抗原性
每种病毒重组核蛋白抗原兔免疫血清都分别与六种白蛉病毒核蛋白抗原进行了免疫印迹杂交。结果显示,每种抗原与相应兔免疫血清反应时均可见特异性目的条带。同时,每种抗原与其余五种免疫兔血清反应时,也在相应位置显示出特异性条带,说明六种白蛉病毒核蛋白之间可能存在血清学交叉反应。结果如图2所示。而以EV71-VP1兔免疫血清作为阴性对照未见任何条带(结果未显示)。
讨论
目前,白蛉病毒的流行区域主要包括非洲、欧州南部、亚洲中部以及北美洲,且有向未流行地区扩散的趋势。为避免这种情况愈演愈烈,应当加强病毒流行区域的防护意识和防控措施。研发更有效、更便捷、敏感性和特异性更强的诊断试剂也尤为重要。
ELISA方法方便快捷,对仪器设备的要求不高,适合疾病流行区域特别是偏远地区的应用和推广。许多针对白蛉病毒核蛋白IgG抗体和IgM抗体的实验室诊断方法被建立起来,如立夫特谷热病毒、托斯卡纳病毒、发热伴血小板减少综合征病毒等。但是,到目前为止,仅有一种基于托斯卡纳病毒重组核蛋白的ELISA试剂盒商业化。这主要是由于白蛉病毒属内存在较严重血清学交叉反应导致的。因此，探究几种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性可以为日后开发商业化ELISA诊断试剂盒奠定基础。
本研究通过原核系统表达并纯化了六种致病性白蛉病毒的核蛋白,并将这六种抗原和六种相应的多克隆兔血清两两组合,分别利用间接ELISA和Western-blotting方法检测,同时还用这六种抗原通过间接ELISA法检测了5份SFTS病人血清,以研究这六种致病性白蛉病毒核蛋白的抗原性,并比较其相互之间的血清学反应情况。实验结果表明,对于多克隆兔血清的检测,无论是间接ELISA法还是Western-blotting法,都提示六种白蛉病毒核蛋白抗原之间可能存在血清学交叉反应;而对于SFTS临床样本的检测结果而言,也同样表明血清学交叉反应可能存在。但是,由于缺乏除SFTS以外的实际感染血清,这六种白蛉病毒核蛋白之间是否确实存在血清学交叉反应还需要进一步的验证。
另外,可能的血清学交叉反应提示我们在实际的检测过程中要引起重视,尤其在以ELISA方法进行检测的过程中,可以尝试截短的NP抗原,以消除其可能存在的共同抗原位点。同时应与其他的诊断方法联合应用,并谨慎作出诊断结论。总之,本研究探究了RVFV、SFTSV、HLV、UUKV、SFNV和SFSV这六种病毒核蛋白的抗原性和免疫反应性,提示了它们之间可能存在血清学交叉反应,为下一步解决这一问题,研究出具有实际应用前景的诊断试剂提供了重要的理论依据。
