2005年国际病毒学委员会第8次分类报告正式在呼肠孤病毒科增加东南亚12节段RNA病毒属（SouthEastAsiandodecaRNAvirus，Seadornavirus）。辽宁病毒（Liaoningvirus，LNV）首次分离自我国东北地区采集的蚊虫标本，为Seadornavirus属中唯一可以引起哺乳动物细胞系发生病变的重要成员。目前，仅在我国有LNV分离的报道。据文献显示，LNV能在各种原代和传代哺乳动物细胞系繁殖，且对小鼠致死；我国东北地区人群和许多种鼠类中LNV抗体阳性率很高，提示LNV可能是人类及动物的重要病原体。
青海省位于称为“地球第三极”的青藏高原，平均海拔在3000m以上，形成独特的高原自然地理环境，并且地形复杂，地貌多样，海拔高度差别大，最低海拔为1650m，最高为6860m。独特的高原特点形成了当地媒介昆虫种类的多样性和独特性，并可能存在由媒介昆虫传播的虫媒病毒。2007年7－8月在青海省采集蚊虫标本，从一组凶小库蚊（Culexmodestus）中分离到1株病毒（QH07130）。通过病毒培养特性、血清学鉴定、病毒基因组电泳带型和序列测定分析，证实QH07130病毒为LNV，这是首次在青海省分离到LNV。
1 材料与方法
1.1 病毒 2007年在青海省采集的凶小库蚊标本中分离到1株病毒，命名为QH07130病毒，由本实验室保存。
1.2 细胞 C6/36和BHK-21细胞均由本实验室保存。DMEM、RP1640、MEM培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司；100U/ml青霉素和链霉素混合液、0.25%胰酶、0.02%Versene均由本所配液室提供。
1.3 间接免疫 荧光试验（IFA）在病毒感染细胞后病变达“+++”时，将细胞吹下，制备抗原片。使用鼠源性黄病毒属、布尼亚病毒属、甲病毒属多克隆抗体和LNV单克隆抗体作为一抗，FITC标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，用IFA对病毒进行初步鉴定。
1.4 病毒核酸电泳试验 采用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取病毒核酸，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察病毒基因组带型，具体方法参照文献［4]。
1.5 分子生物学检测 用QIAampViralRNA试剂盒（美国Qiagen公司）提取病毒RNA，利用随机引物和ReadytoGoTMYouprimeFirstStrandBeads试剂盒（英国GEHealthcare公司）制备cDNA。采用LNV第10节段特异性引物（LNVS10REV1：GTT CCC GGA CTTTCA CAG CTA CTT TC；LNVS10FOR1：ATG AGT AACGTG ACA GAG ATT CGT GC）进行PCR鉴定。对PCR产物回收，连接入pGEMTeasy载体（美国Promega公司）进行序列测定。
1.6 序列分析 从GenBank中收集相关病毒的序列信息，应用ClustalX1.83软件进行核苷酸序列比对，MegAlign分析核苷酸差异度，Mega4.0软件完成病毒系统进化分析。
2 结果
2.1 细胞病变特点 将QH07130病毒在C6/36和BHK-21细胞上连续感染3代，结果发现QH07130病毒在C6/36细胞上引起病变，在BHK-21细胞无病变产生。经过连续3次传代后，QH07130病毒能够在C6/36细胞上稳定病变，感染48h后即开始出现病变，72h细胞病变可达“+++”。细胞病变主要表现为细胞圆缩、间隙增大和脱落（图1）。
2.2 病毒抗原性检测 采用QH07130病毒感染的C6/36细胞制作抗原片，分别以黄病毒属、布尼亚病毒属、甲病毒属多克隆抗体和LNV单克隆抗体进行IFA检测。结果显示，QH07130株只与LNV单克隆抗体产生强荧光信号，荧光颗粒主要分布在胞浆中，与其他抗体均为阴性反应，提示QH07130病毒为LNV（图2）。
2.3 病毒基因组带型分析 采用RNA-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验对QH07130病毒进行基因组带型分析，以Seadorna病毒属的LNVNE9731株、Kadipiro病毒（Kadipirovirus，KDV）和版纳病毒（Bannavirus，BAV）作为对照。结果显示，QH07130病毒与LNV、KDV和BAV一样，都具有12节段双链RNA的特征性条带，提示QH07130病毒为Seadorna病毒属的LNV。
2.4 分子生物学鉴定 采用LNV第10节段特异性引物对QH07130病毒进行PCR鉴定。结果显示，QH07130病毒经PCR扩增后得到特异性目的条带，将PCR产物进行回收，连接，测序，获得的核苷酸序列大小为844bp。在NCBIBlastn进行比对，该序列与LNVSX0771和NE9712株相应核苷酸序列的同源性分别为99.5%和98.0%，与LNVNE9731株的同源性为78.0%，证实QH07130病毒为LNV。
2.5 系统进化分析 选取GenBank中与LNV第10节段同源的Seadorna病毒属成员和本科室分离的其他LNV的核苷酸信息，进行序列比对，并构建基于Neighborjointing方法系统发生树。结果显示，LNV、KDV和BAV位于进化树的不同分支，具有明显的种属差异，QH07130病毒与其他地区LNV分离株位于同一分支上，并且与LNVSX0771和NE9712株的进化距离较近（图3）。
3 讨论
目前Seadornavirus仅有3个成员：BAV、LNV和KDV。动物实验表明，小鼠首次感染LNV后，会出现虚弱乏力，然后康复；再次接种后，病毒能在小鼠体内再繁殖，小鼠于感染后死于鼻腔和皮下等多部位出血。因此，LNV对人畜可能存在潜在威胁。
自1997年在我国东北地区采集的背点伊蚊（Aedesdorsalis）中首次分离到LNV，我国新疆、山西、甘肃、辽宁等地也多次分离到该病毒。本次从位于青藏高原的青海省也分离到LNV，说明LNV具有极强的适应能力，可以在多种环境中生存，丰富了对LNV地理分布的了解。系统进化分析发现，所有的LNV分离株都位于同一进化分支中，并进一步分为2个亚群，除东北分离株LNVNE9731外，我国其他地区的LNV分离株均位于同一个亚群中，其中青海省新分离株QH07130与东北分离株LNVNE9712的进化距离较近，尤其是与SX0771株的距离最近。从地理分布角度研究，青海省与山西、吉林省分别位于我国的西北、中部和东北地区，地理上相距较远，而从上述地区分离的LNV进化距离却较近，可能与LNV的传播路线有关，需要开展深入研究。
青海省地处青藏高原，地域广阔，地理景观复杂，蚊虫种类较多，理论上可能传播多种虫媒病毒。本次从青海省凶小库蚊中分离到的QH07130株鉴定为LNV具有重要意义。据文献报道，凶小库蚊在当地较为多见，喜嗜人血，并且是多种病毒的重要传播媒介。我国曾报道从凶小库蚊中分离到BAV。
1964年，在法国南部采集的凶小库蚊中分离到1株西尼罗病毒（WestNilevirus，WNV）。实验室条件下，凶小库蚊对WNV的易感性高达89.2%，传播率达54.5%，是WNV的主要传播媒介。1977年，在捷克摩拉维亚地区的凶小库蚊中分离到1株Tahyna病毒（THAV），并在实验室条件下证实凶小库蚊对THAV的传播能力。上述经凶小库蚊传播的虫媒病毒都是人类发热和脑炎的重要病原，与人类疾病具有密切关系。本次从凶小库蚊中分离到LNV，进一步增加了对该蚊种作为传播媒介的认识。由于凶小库蚊是青海省的重要蚊种，分布广泛，且LNV具有潜在的致病性，因此需进一步加强检测当地蚊虫携带虫媒病毒情况，以及进一步证实LNV与当地疾病的关系，为当地虫媒病毒病的预防和控制提供科学依据。
参考文献
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