作物病虫害每年给农业生产造成了惊人的损失，而合理有效地使用杀虫农药是控制害虫的有效途径之一。生物农药由于具有防治效果好、特异性强、选择性高、开发利用途径多、不易产生抗性等特点，已成为发展绿色农业的理想选择，也是中国农业可持续发展和生态环境保护的重要途径。微生物源农药作为生物农药的主要来源，具有明显的生态效益、经济效益和社会效益。因此，开发研究新微生物源农药已成为当前农药研究的热点。
本研究从广西玉林土壤中分离筛选出一株真菌菌株 YLZ42，通过形态特征，18S rDNA、ITS 序列测定和系统发育分析对其进行鉴定。同时，为研究该菌株是否具有潜在杀虫利用价值和田间应用前景，测定其发酵液乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾的杀虫活性，并对 YLZ42 发酵液活性物质稳定性进行初步研究，旨在为菌株 YLZ42 的进一步研究和应用提供参考。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 于 2012 年 9 月从广西玉林等采集土壤样品 17 份，自然风干，备用。
1.1.2 供试虫 卤虫卵 ：购于成都益友水族，人工海水孵化 ；蚜虫 ：由四川省农科院植保所提供 ；小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾 ：购于河南济源白云实业公司，由其提供的饲料孵化。
1.1.3 主要培养基 分离真菌培养基 ：孟加拉红培养基（购于北京奥博星生物技术有限责任公司）；真菌培养基 ：PDA 培养基 ；发酵培养基 ：葡萄糖 1%，可溶性淀粉 1%，花生饼粉 0.2%，黄豆饼粉 0.2%，蛋白胨 0.1%，KH2PO40.08%，pH7.0 ；大肠杆菌培养基 ：LB 培养基。
1.1.4 主要试剂 DNA Marker、2 TransStartTMFastPfuPCR SuperMix、pEASY-blunt 载体、E.coliTrans-T1 感受态细胞均购于北京全式金生物技术有限公司 ；真菌基因组 DNA 提取试剂盒，18S rDNA、ITS 通用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司提供 ；其他常规试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 将土壤样品制成菌悬液，进行梯度稀释后涂布在孟加拉红培养基平板上，26℃恒温培养。待长出菌落后，适时挑取形态、颜色不同的单菌落，在 PDA 培养基平板反复划线培养，直至获得菌落形态一致的纯菌株，作为待测菌株，4℃保藏，备用。
1.2.2 杀虫活性菌株的筛选
1.2.2.1 样品制备 挑取待测菌株，接种于发酵培养基中，置于 26℃、180 r/min 摇床连续振荡培养 5d，过滤除去菌体，收集滤液。取 40 mL 滤液用等体积乙酸乙酯萃取两次，35℃减压浓缩后得浸膏，用1 mL 二甲基亚矾（DMSO）溶解（发酵液 /DMSO ：40/1），再加入 19 mL 体积的无菌水，充分混匀后得到 A 类样品，备用。另取 10 mL 滤液，作为 B 类样品，备用。
1.2.2.2 初筛 参考 Solis 的方法，取 A 类和 B 类样品各 100 μL，分别置于 96 孔板的微孔中，再加入200 μL 的卤虫培养液（约 15-35 只卤虫），每个样品3个重复。同时，以蒸馏水及相同浓度的DMSO做空白对照。28℃放置 24 h 后，用双目解剖镜观察，记录卤虫死亡数。在统计总数时，向孔板中滴入 1 滴浓度为 40% 的盐酸处死所有的卤虫，计算校正致死率。校正致死率（%）＝（X-CK）/（1-CK）×100%其中，X 为样品孔致死率，CK 为对照孔的致死率。
1.2.2.3 复筛 采用喷雾法，从田间采取菊科植物上沾有大量蚜虫的叶片，将其放置于铺有滤纸的培养皿中，将 A 类样品喷雾于叶片上，重复 3 次，室温（15℃-25℃）培养 24 h 后进行观察，计算校正死亡率。
1.2.3 活性菌株的鉴定
1.2.3.1 培养特征和形态特征 将菌株接种到 PDA培养基 26℃倒置培养 3-10 d，观察菌株的气生菌丝、基内菌丝、孢子颜色等特征。将菌株接种于 PDA 培养基上，26℃插片培养，分别于 3、5 和 7 d 取出玻片，通过光学显微镜观察菌株的形态特征。
1.2.3.2 18S rDNA、ITS序列测定和系统发育分析 采用真菌基因组 DNA 提取试剂盒提取菌株基因组 DNA，作为 PCR 扩增的模板，序列扩增采用真菌通用引物对 ：18S rDNA 引物（NS1 ：5'-GTAGTCAT-ATGCTTGTCTC-3' ；NS8 ：5'-TCCGCAGGTTCACCTA-CGGA-3'），ITS 引 物（ITS1 ：5'-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGC-3' ；ITS4 ：5'-TCCTCCGCTTATTGATATG-C-3'）。PCR 反应体系为 50 μL ：基因组 DNA 1 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，SuperMix 25 μL，ddH2O 22 μL。PCR 反应条件为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 20 s，55℃退火 20 s，72℃延伸 40 s，共35 个循环 ；72℃终延伸 5 min。扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后割胶回收纯化，回收产物连接pEASY-blunt 载体并转化至 E.coliTrans-T1 感受态细胞，PCR 验证阳性克隆子后，交由华大基因科技有限公司测序。测序数据经过拼接后，通过 NCBI网站在线 BLAST 比对分析，调取相关序列。序列经 CLUSTAL X（1.8）比对分析后，用 MEGA5 软件以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树，Bootstrap 设置为 1 000 次重复。
1.2.4 生物测定 将菌株发酵液滤液用等体积乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，减压蒸馏浓缩 30倍后，与人工饲料混拌均匀，通风厨中蒸发干燥 2 h后，分装于 24 孔板微孔中，再分别加入小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾 3 龄幼虫，每个孔一头，每种昆虫重复 20 孔，于 26℃、相对湿度 60%-70% 的条件下，避光培养，48 h 后观察、记录昆虫状态和死亡情况。
1.2.5 发酵液活性物质稳定性研究 以卤虫为指示虫，按照 1.2.2.2 的方法测定发酵液在不同条件下处理后的杀虫活性，根据校正死亡率的改变确定其稳定性。
1.2.5.1 对紫外线和蛋白酶 K 稳定性的测定 取少量 YLZ42 发酵液滤液，在 25 W 紫外灯下（距离约10 cm）照射 3 h，以未处理发酵液滤液为对照测定其杀虫活性，重复 3 次 ；YLZ42 发酵液滤液中加入蛋白酶 K，使其终浓度为 100 μg/mL，以未处理发酵液滤液为对照，37℃水浴 3 h 后测定其杀虫活性，重复 3 次。
1.2.5.2 热稳定性分析 将待测发酵滤液分别置于室温（25℃）及 40℃、60℃、80℃、100℃四个温度水浴 30 min 和 60 min，降至室温后，以卤虫为试虫测定杀虫活性，计算校正死亡率。
1.2.5.3 酸碱稳定性试验 分别用 1 mol/L 的 HCl 或1 mol/L的NaOH调节pH，分别调到pH为1、3、5、7、9、11 和 13，然后将各 pH 调回 7 左右，测定杀虫活性，计算校正死亡率。
2、结果
2.1 菌株分离与杀虫活性筛选
从土样中分离出 165 株真菌。杀虫活性初筛结果（表 1）表明，发酵产物对卤虫校正死亡率在60%-100% 的菌株有 6 株，占初筛菌株总数的 40%，其中 YLZ42 的发酵液滤液及乙酸乙酯萃取物对卤虫的校正致死率均为 100%。
选取初筛杀虫效果最好的 4 株菌株，进行复筛，结果（表 2）表明，有 3 株菌株发酵产物对蚜虫的校正死亡率在 80% 以上，其中 YLZ42 对蚜虫的致死率 91.4%，校正死亡率为 90.1%。
2.2 菌株YLZ42的鉴定
2.2.1 培养特征和形态特征 菌株在 PDA 培养基上26℃培养 3-10 d，其菌丝生长较缓慢，菌落圆形，具轮纹，白色至灰白色，气生菌丝不发达，边缘呈轮纹状向外扩散，平板背面产生淡黄褐色色素 ；菌丝具隔，分生孢子呈椭圆形、淡色，分生孢子梗为帚状分枝（图 1）。与 Rossman，张向民等对生赤壳科（Bionectriaceae）真菌的描述一致。
2.2.2 18S rDNA、ITS 序列测定和系统发育分析 测序所得序列经校对后提交 GenBank，并在 NCBI 上进行 Blast 比较分析。菌株 YLZ42 的 ITS 序列长度为570 bp，登录号为 KJ145326，与Bionectria ochroleuca（EU273558）序列相似度为 99% ；18S rDNA 长度为 1 767 bp， 登录号为 KJ145325， 与Bionectriaochroleuca（GU112755）序列相似度为 99%。以 18SrDNA 和 ITS 序列为基础，根据序列同源性从高到低的顺序选取有效菌株序列，经 CLUSTAL X（1.8）比对分析后，利用 Mega5.0 软件构建系统发育树（图2）。从构建的系统发育树可以看出，菌株 YLZ-42 与Bionectria ochroleuca处于同一分支，亲缘关系最近。
2.3 生物测定
菌株 YLZ42 发酵液的乙酸乙酯萃取物对 3 种供试虫有明显的毒杀效果，其中，对棉铃虫的毒杀效果最好，校正死亡率达 100%，对小菜蛾及甜菜夜蛾的毒杀效果次之，校正死亡率分别为 84.2% 与78.9%，结果如表 3 所示。
2.4 发酵液活性成分的稳定性研究
2.4.1 对紫外线和蛋白酶 K 的稳定性 YLZ42 发酵液滤液分别经紫外线照射3 h和蛋白酶K处理3 h后，其杀虫活性不变（校正死亡率为 100%），说明杀虫活性物质对紫外线和蛋白酶 K 不敏感。
2.4.2 热稳定性 YLZ42 发酵液在 40℃、60℃和80℃三个温度水浴处理 30 min 和 60 min 后，杀虫活性几乎不变。而在 100℃水浴处理 60 min 后，略有降低（图 3），表明 YLZ42 发酵液杀虫活性在 40℃-100℃内基本稳定。
2.4.3 pH 稳定性 YLZ42 发酵液在 pH1-11 条件下校正死亡率几乎没有变化，表明其杀虫活性物质在pH1-11 条件下稳定，当 pH 为 13 时，YLZ42 发酵液杀虫活性消失（图 4）。
3、讨论
随着人们环保意识的提高，对无公害农产品的需求越来越高。由于微生物源农药具有明显的生态效益、经济效益和社会效益，开发研究新微生物源农药已成为当前农药研究的热点。本研究在进行杀虫活性筛选时，选用了卤虫作为初筛指示虫，主要是考虑到卤虫模型具有检测快速、操作简单、廉价等特点和优势，适于杀虫活性物质的高通量筛选。钟佳等就曾以卤虫为靶标，对海洋放线菌、植物内生菌代谢物的杀虫活性进行了筛选。除此之外，在应用该方法进行杀虫活性快速筛选时，同时测定了菌株的发酵液滤液及其乙酸乙酯萃取物的杀虫活性，这样做既能够保证测量结果的准确性，又为进一步分离纯化杀虫活性物质提供了依据。
生赤壳属（Bionectria） 是1999 年由 Rossman等根据形态学及分子生物学特征，从丛赤壳科菌种独立出来而建立的一个新属，被归类为生赤壳科（Bionectriaceae），肉座菌目（Hypocreales）。由于是新定义的一个属，所以国内外对其研究相对较少。
目前，国内研究报道主要集中于淡色生赤壳菌对植物病原菌的防治，如陆铮铮等报道了淡色生赤壳菌对烟草青枯菌的拮抗作用，余艳等报道了淡色生赤壳菌的抗菌和杀细胞作用，但鲜有人对其杀虫活性进行过研究和报道。通过卤虫模型，本研究分离筛选出一株具有杀虫活性的淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）YLZ42。生物测定表明该菌株发酵液的乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾有较好的毒杀效果，具有潜在的杀虫利用价值和田间应用前景。同时，利用卤虫为指示虫，对YLZ42 发酵液稳定性进行了初步研究，丰富了淡色生赤壳菌的研究内容，也为后续研究中对杀虫活性物质的功能研究和结构解析等提供了参考。
4、结论
通过卤虫筛选模型，筛选了一批具有杀虫活性的真菌菌株。其中 YLZ42 的代谢物对卤虫的校正致死率为 100%，对蚜虫校正死亡率为 90.1%。通过培养特征、形态特征以及 18S rDNA、ITS 序列系统发育分析，鉴定菌株 YLZ42 为淡色生赤壳菌（Bionectriaochroleuca）。YLZ42 发酵液乙酸乙酯萃取物对小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾具有明显的毒杀活性，其校正死亡率在 78.9% 以上。YLZ42 发酵液的稳定性分析表明活性成分在 100℃处理 60 min，pH1-11 条件下仍具有较强的杀虫活性。
参考文献：
［1］贺伟华 , 黄长干 . 生物农药对我国农业发展的影响及对策分析［J］. 农业考古 , 2007, 6 ：315-317.
［2］施跃峰 . 微生物杀虫剂研究进展［J］. 植物保护 , 2000, 5 ：32-34.
