筛选并确定解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2悬浮剂的最佳配方

　　芽孢杆菌(Bacillusspp.)能够形成耐热、耐旱、抗紫外线的芽孢,是研制生防菌剂的良好材料。多种解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株因其具有控制植物病害、促进植物生长、提高作物产量等优势,在生物防治制剂中显示出广阔的应用前景。解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2(简称Y2,专利号:ZL200310104195.6)是笔者所在实验室从小麦根系土壤分离的一株具有广谱抑菌促生长作用的生防菌株,能有效防治玉米大斑病、小斑病、圆斑病等真菌性病害,促进多种植物插条生根,是一种很好的生物防治制剂,但其制剂较单一,目前仅有可湿性粉剂产品。为克服Y2可湿性粉剂颗粒较大、易于沉降和分散性较差等缺点,笔者筛选并确定了Y2悬浮剂的最佳配方,旨在为其产品的商业化生产提供理论依据。

　　1、材料与方法

　　1.1供试材料

　　供试菌株:解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2菌粉,芽孢含量≥1.0×1011cfu/g,芽孢率≥95%;润湿分散剂:烷基萘磺酸缩聚物钠盐(MorwetD-425)、亚甲基双萘磺酸钠(NNO)、聚乙烯醇(PVA)、苯乙基酚聚氧乙烯醚(农乳602)、烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚(农乳34)、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯(吐温-80)、烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10);增稠剂:黄原胶、硅酸镁铝、羧甲基纤维素(CMC);防冻剂:甘油;防腐剂:苯甲酸钠、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯;紫外(UV)保护剂:黄原胶、羧甲基纤维素(CMC)、刚果红、淀粉、糊精、尿素、抗坏血酸(VC)、纯牛奶;消泡剂:正辛醇;主要仪器:粉碎机、小型立式砂磨机、旋转粘度计、激光粒度分析仪、台式离心机、恒温摇床等。

　　1.2制剂加工与初始比例

　　将Y2菌粉与一定比例助剂补足水混合均匀后经砂磨机砂磨4h后制成各种不同的悬浮剂。初始制剂成分配比(质量百分数,下同):原粉5.00%、润湿分散剂总计≤10.00%、紫外保护剂0.30%、防腐剂0.30%、防冻剂5.00%、消泡剂0.20%。

　　1.3配方的筛选

　　1)润湿分散剂。采用流点法筛选润湿分散剂品种,试验重复4次。选用对供试原粉流点值较低的润湿分散剂进行下一步试验,按悬浮剂配制方法,配制几个样品,测定样品悬浮剂的各项指标,确定润湿分散剂组合及用量。

　　2)增稠剂。按照配方要求,将粘度调节剂按不同的含量制成样品。将样品经(54±2)℃贮存14d后,测定各样品的倾倒性、流动性及分层情况。

　　3)紫外保护剂。将保护剂按0.30%比例添加到发酵液中,混合均匀并分别稀释后涂布在LB平板上,置于距离紫外灯40cm处,分别照射30、60、90s后统计存活率。以不加保护剂作对照,每个处理重复4次。保护效能指数=(处理芽孢存活率-对照芽孢存活率)/(100-对照芽孢存活率)。

　　4)防腐剂。以上述配方为基础,加入不同种类和含量的防腐剂,配制不同的样品。将样品经室温贮存14d后,测定产品的悬浮率和霉变程度。

　　5)防冻剂。将筛选出的润湿分散剂、增稠剂、保护剂、防腐剂配制成悬浮剂样品后,添加不同浓度的防冻剂。将样品经(0±2)℃贮存24h后,测定产品的悬浮率、析水率和分散性。

　　1.4悬浮剂稳定性的测试

　　将试验结果得到的最佳配方制作成悬浮剂样品,分2组装入安碚瓶中,每组5瓶,分别进行冷贮[(0±2)℃贮存7d]和热贮[(54±2)℃贮存14d]处理,测定悬浮剂的芽孢含量、悬浮率、流动性、粘度等各项指标。

　　1.5制剂质量指标的测定

　　按照《中华人民共和国国家标准》对解淀粉芽孢杆菌Y2悬浮剂的各项质量指标进行测定。悬浮率测定参照GB/T14825-2006的方法;pH值测定参照GB/T1601-1993的方法;冷贮稳定性测定参照GB/T19137-2003的方法;热贮稳定性测定参照GB/T19136-2003的方法;分散性、倾倒性、持久泡沫量测定参照易敏等的方法;有效成分采用平板菌落计数法测定;粘度采用旋转粘度计测定;颗粒直径采用激光粒度仪测定。

　　1.6数据处理与统计方法

　　应用SPSS19.0对所得试验数据进行统计分析,采用Excel2007进行图表绘制。

　　2、结果与分析

　　2.1润湿分散剂的筛选

　　1)润湿分散剂的流点。在预试验助剂与Y2生物相容的基础上,选择7种生物相容性较好的润湿分散剂,用流点法测定各自流点,比较其润湿分散能力(表1)。润湿分散剂流点越小,表明润湿分散能力越强。

　　由表1可知,7种润湿分散剂的流点由小到大依次为农乳34<OP-10<农乳602<NNO<D425<吐温80<PVA,PVA与其他6种润湿分散剂间存在极显著差异,在润湿分散剂配方优化筛选中将被剔除。

　　2)润湿分散剂配方的优化。根据预试验,样品中的增稠剂、防腐剂和防冻剂分别为黄原胶、对羟基甲酸甲酯和甘油,添加量分别为0.20%、0.10%和5.00%,配制成不同的样品后,测定悬浮剂的悬浮率和分散性(表2)。

　　由表2可知,5号样品中润湿分散剂选用农乳34、D-425以及OP-10组合,其用量分别为2.50%、2.00%和1.50%,样品的悬浮率最高达96.20%,分散性能优越。

　　2.2增稠剂的确定

　　以黄原胶、硅酸铝镁及羧甲基纤维素3种增稠剂为筛选对象,按照已筛选出的润湿分散剂,加入不同含量和比例的增稠剂,配制成不同的样品后,测定悬浮剂的倾倒性和流动性(表3)。由表3可知,当样品中黄原胶的添加量为0.15%时,悬浮剂的倾倒性和流动性均良好,且没有分层状况。

　　2.3紫外保护剂的选择

　　测定结果表明,8种紫外保护剂不同照射时间的保护效能表现出差异性(表4)。照射30s后,各保护剂均有不同程度的保护作用,除糊精和纯牛奶保护效能指数低于0.50外,其余均高于0.60,VC保护效率最高0.93;照射60s后,淀粉和VC保护效能急剧下降到0.19和0.11;照射90s后,黄原胶、CMC和尿素3种紫外保护剂仍然保持0.40以上的较高保护效能。

　　CMC生物相容性较差(预试验),黄原胶已选作为增稠剂,若再加入会影响体系的平衡,因此,在黄原胶添加量的基础上选择尿素作为保护剂。进一步筛选结果显示,在0.15%黄原胶的基础上添加0.15%和0.20%尿素具有较好的保护效果,且无显著差异(表5)。综合分析并考虑成本因素,确定以尿素为悬浮剂的保护剂。

　　2.4防腐剂的筛选

　　选择与Y2生物相容性较好的山梨酸钾、苯甲酸钠和对羟基苯甲酸甲酯,按照试验筛选出的助剂,加入不同的防腐剂,配制成不同的样品,再将样品经室温贮存14d后测定其悬浮率和霉变度(表6)。测定结果表明,加入0.06%对羟基苯甲酸甲酯防腐效果较好,制剂前后悬浮率未发生显著变化且无霉变现象;而0.10%~0.30%山梨酸钾和苯甲酸钠处理后,制剂的悬浮率下降明显且仍有霉变。

　　2.5防冻剂的确定

　　制作悬浮剂的一些助剂在温度较低时可从液态凝固成固态。为防止产品在贮存过程中出现结晶现象而影响使用效果,选用相容性好的甘油进行浓度配方。按照试验筛选得到助剂配方,加入不同含量的甘油,配制成不同的样品,然后将样品经过(0±2)℃贮存24h后,测定产品的悬浮率、析水率和分散性(表7)。测定结果表明,5.00%甘油的防冻效果好于3.00%和4.00%的甘油,且样品中无析水现象。

　　2.6消泡剂的选择

　　在悬浮剂砂磨过程中,会产生大量的泡沫,需要加入小量消泡剂。试验结果表明,正辛醇添加到0.20%时,便有良好的消泡效果。

　　2.7悬浮剂的稳定性

　　将试验结果得到的最佳配方:Y2菌粉5.00%,农乳342.50%,D-4252.00%,OP-101.50%,黄原胶0.15%,尿素0.15%,对羟基苯甲酸甲酯0.06%,甘油5.00%,正辛醇0.20%,水83.44%,采用湿磨法研磨4h后制得样品后,测定悬浮剂的各项质量指标(表8)。

　　悬浮剂稳定性的测定结果表明:Y2悬浮剂的芽孢含量达50亿/mL,悬浮率达92.00%以上,≤5μm的粒径高于96%,pH值稳定在7.5~7.6,粘度610~620Pa·s;制剂的倾倒性好,热贮和冷贮前后差异不大。

　　3、讨论

　　紫外光对活体的杀伤作用是影响生防制剂在田间稳定性的重要因素,在生防制剂中加入一定量的紫外保护剂来保障生防活体在环境中的存活率是一种常用手段。本试验结果表明,黄原胶和尿素在生物相容性良好的条件下对Y2芽孢表现出良好的防护作用。黄原胶防护效果与程立君等的研究结果一致。然而,在紫外保护剂筛选时,紫外灯照射时间存在较大差异,从照射30s到24h不等,其中以短时间照射为多。本试验中以紫外灯照射5min后,全部Y2芽孢几乎死亡。尿素对作物叶片损伤较小,适宜作叶片追肥。袁立海等的研究结果表明,尿素的叶面追肥量不超过5.00%时有良好增产效果且不会导致烧苗。本试验添加0.15%尿素,具有芽孢紫外保护剂作用,同时还具有叶片追肥的功效,但增产效果有待进一步验证。

　　悬浮剂实际上仍是水分散体系,其中添加的某些助剂是有机营养成分,在室温下容易被外界杂菌所利用,导致制剂系统平衡的破坏。同时,生防活体微生物也有自身利用的条件。为了防止出现这些现象,农药剂型中常加入山梨酸钾、苯甲酸钠和甲醛。本研究结果显示,制剂中添加0.10%~0.30%的山梨酸钾、苯甲酸钠无防腐效果,其原因是该2种物质为酸性防腐剂,而解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2悬浮剂是弱碱性制剂(pH7.6)。因此,将酸碱适应范围大的对羟基苯甲酸甲酯作为Y2悬浮剂的防腐剂,能明显抑制霉变和芽孢萌发,尽管其价格是苯甲酸钠的10倍、山梨酸钾的3倍,但添加量只需二者的1/10~1/5,制剂的成本相差无几。

　　参考文献：
　　[1]王英国,王军华,权春善,等.解淀粉芽孢杆菌抗菌活性物质的分离纯化及抑菌活性研究[J].中国生物工程杂志,2007,27(6):41-45.