摘要
目前牛的商品化冻精中含有较多能影响精子体外获能的成分，例如抗冻剂等；在精子体外获能之前，需先对解冻的精液进行必要的分离纯化，去除各种添加剂，为精子体外获能提供最优环境。因此，研究不同精子纯化方法对体外受精的影响、确定最优精子纯化方法以期提高体外胚胎生产效率具有重要意义。
同期发情处理是胚胎移植过程中的关键一环，受体牛的发情同步及黄体质量会直接影响胚胎移植后的受胎率。本研究选取前列腺素和孕酮两种外源生殖激素，以荷斯坦母牛为试验对象，研究不同同期方案对胚胎移植受体牛的影响，以期提高受体母牛的利用率及胚胎移植后的受胎率。
试验一：不同精子纯化方法对牛体外胚胎生产的影响本试验选择 Percoll 密度梯度离心法和上浮法处理冻精，再与体外成熟后的卵母细胞进行受精，重复 8次，统计精子活力、精子密度、受精率、卵裂率和囊胚率。试验结果表明，Percoll 法处理后的精子活力（0.65）与上浮法处理后（0.68）无显着差异（p> 0.05），但两组均显着高于未处理的精子活力（0.41）（p < 0.05）；Percoll 组精子密度（9.08×106/m L）显着高于上浮组（7.60×106/m L）（p < 0.05）。
Percoll 组受精率（83.70%）和卵裂率（62.61%）显着高于上浮组（77.99% vs 51.62%，p < 0.05）；Percoll 组囊胚率（31.18%）与上浮组囊胚率（30.94%）无显着差异（p = 0.06）。
试验二：不同同期发情方法对受体牛胚胎移植的影响选择 90 头健康、膘情适中的荷斯坦青年牛，随机分为两组，分别按照CIDR+PG和 PG+PG 同期方案进行激素注射，另挑选15 头青年牛等待自然发情（对照），在发情后第 7d 用B 超对受体牛黄体直径（CLD）进行测量，对符合条件的受体牛进行胚胎移植。试验结果表明，CIDR+PG 组发情率显着高于PG+PG 组（91.11% vs 84.44%, p< 0.05）；CIDR+PG 组中85.37%（35/41）的发情牛集中在撤栓后的2 d 内，PG+PG 组中 73.68%（28/38）的发情牛集中在注射第二针PG 后的2-3 d。
CIDR+PG 组黄体合格率（70.73%，29/41）显着高于PG+PG 组（65.79%，25/38）（p < 0.05）。
将 CLD 分为10 mm≤CLD≤15mm、15 mm
CIDR+PG 组间受胎率无显着差异（33.33% vs 35.71% vs 33.33%，p > 0.05）；PG+PG 组间受胎率无显着差异（37.50% vs 36.36% vs 33.33%，p > 0.05）；CIDR+PG 组与PG+PG 组之间受胎率也无显着差异（p> 0.05）。
研究结果表明，与上浮法相比，Percoll 密度梯度离心法可以提高精子的利用率、受精率和胚胎卵裂率。与PG+PG法相比，CIDR+PG法处理的受体牛发情率更高、发情时间更为集中、黄体合格率更高且受体牛利用率更高。不同同期发情方法处理后受体牛的CLD与受胎率之间无显着差异。
关键词 ： 精子纯化；同期发情；黄体直径；受胎率；牛。
ABSTRACT
In the current commercial frozen semenof cattle, there are many factors that can affect invitro sperm capacitation, such as antifreeze. Before in vitro sperm capacitation, it isnecessary to separate and purify thawed semenfirst, removing various additives, so as toprovide the best environment for in vitro sperm capacitation. Therefore, it is of greatsignificance to study the effects of different sperm purification method on in vitrofertilization, and to determine the optimal sperm purification method in order to improve invitro embryos production efficiency.
Synchronous estrus is a key part in the process of embryo transfer. The synchronizationand the quality of corpus luteum of the recipient cows will directly affect the conceptionrate after embryo transfer.
In the study, Holstein cows were used as the test subjects and twoexogenous reproductive hormones, prostaglandin and progesterone were selected to studythe effects of different synchronous programs on embryo transfer recipient cows in order toimprove the utilization rate of recipient cows and conception rate after embryo transfer.
Experiment 1: Effect of different sperm purification method on bovine embryoproduction in vitro.
In this experiment, Percoll density gradient centrifugation and swim-up method wereused to treat frozen semen, and then fertilized with oocytes after in vitro maturation,repeated 8 times, and counted sperm motility, sperm density, fertilization rate, cleavage rate,and blastocyst rate.
The results of the test showed that there was no significant difference insperm motility between Percoll treatment (0.65) and swim-up treatment (0.68) (p > 0.05)，but the sperm motility in both groups was significantly higher than untreated group (0.41)(p < 0.05).The sperm density in Percoll group (9.08×106/m L) was significantly higher thanthat in swim-up (7.60×106/m L) (p < 0.05). The fertilization rate of Percoll group (83.70%)was significantly higher than that of the swim-up (77.99%) (p < 0.05). The cleavage rate ofPercoll group (62.61%) was significantly higher than that of the swim-up (51.62%) (p <0.05). There was no significant difference in blastocyst rate between the Percoll group(31.18%) and the swim-up (30.94%) (p = 0.06).
Experiment 2: Effects of different synchronous estrus methods on embryo transfer ofrecipient bovine.
Selected 90 healthy and moderately fat Holstein young cattle, randomly divided into two groups, according to the CIDR+PG and PG+PG methods for hormone injection, and 15young cattle waiting for natural estrus (control), after the first estrus on 7 d, the recipientbovine corpus luteal diameter (CLD) was measured by B-ultrasound, and embryo transferwas performed on eligible recipient cattle. The test results showed that the estrus rate wassignificantly higher in the CIDR+PG than the PG+PG group (91.11% vs 84.44%, p < 0.05);and in the CIDR+PG group, 85.37% (35/41) of estrus cattle were mainly in estrus within 2 dafter the withdrawal of CIDR, while 73.68% (28/38) of estrus cattle in the PG+PG groupwere mainly in estrus within 2-3 d after the second injection of PG. The qualified rate ofcorpus luteum in the CIDR+PG (70.73%, 29/41) was significantly higher than that in thePG+PG group (65.79%, 25/38) (p < 0.05).
The CLD was divided into three groups: 10 mm≤CLD≤15 mm, 15mm
The research results show that Percoll density gradient centrifugation can improve spermutilization, fertilization rate and embryo cleavage rate compared with swim-up method.
Compared with the PG+PG method, CIDR+PGmethod had higher estrus rate, moreconcentrated estrus time, higher corpus luteum qualification rateand higher utilization rateof recipient cattle.
There was no significant difference between CLD and conception rate inrecipient cattle treated with different synchronous estrus methods.
KEY WORDS : sperm purification; synchronous estrus; corpus luteum diameter; conception rate; cow。
文献综述。
第一章 牛体外胚胎生产及胚胎移植的研究进展
1.1、牛体外胚胎生产的研究进展 。
体外胚胎生产（IVEP）技术，也被称为体外受精（IVF）技术，被誉为家畜繁殖领域中继人工输精（AI）、胚胎移植后的又一次技术革命(方俊顺2006)。其程序主要包括卵母细胞的收集、卵母细胞的体外成熟（IVM）、精子获能、IVF和早期胚胎体外培养（IVC）(蒋涛et al. 2005)。目前，随着胚胎工程和畜牧业的快速发展，对价廉且质优的胚胎使用量逐渐增多，仅靠超数排卵收集到的胚胎已无法满足科研与生产上的需求(许红喜et al. 2018)。因此，研究和发展IVM、IVF、IVC以及胚胎冷冻保存技术，使胚胎在体外条件下能够快速量产并进行良种卵母细胞和胚胎的冷冻保存，具有深远的现实意义。
IVEP不仅能够充分深挖良种母畜的繁殖潜能，为胚胎生物技术（胚胎干细胞系的建立、基因编辑、胚胎嵌合、胚胎性别的鉴定、胚胎移植等）提供研究样本；而且能够揭示在成熟、获能过程中，两性配子的生理、形态发生的变化以及受精、胚胎早期发育的机制；也有利于精子的质量评估及优良精子库的建立，为其他学科提供关键的理论依据；除此之外，其在开发珍稀动物、拯救濒危动物等方面也颇有意义(马云2003)。为此，IVEP越来越受到重视。
1.1.1、国内外牛体外胚胎生产的现状。
国际胚胎移植协会（IETS）—一个全球性的组织，其主要工作是统计AETA、CETA、AETE和其他国家胚胎移植协会或相关机构关于动物胚胎的相关数据，如各种动物的供体数、可用胚胎数、体内（IVD）胚胎数、体外生产（IVP）胚胎数、冷冻胚胎数、鲜胚数、储存及进出口的胚胎数等(杨炜峰2003)，目标是促进家畜胚胎移植及其相关技术的快速高效发展。
据IETS(Viana 2019)统计，2018年四种最具代表性的农场动物（牛、马、山羊、绵羊）的胚胎数据中，牛胚胎数占各物种胚胎总数的96.7%（1499367枚），位列榜首。
与2017年相比，牛的胚胎数小幅度增长了0.8%；而与2014-2017年相比，总体增长了23.4%。与2017年相比，2018年IVD胚胎数减少了5.1%，而IVP胚胎数增加了2.6%，且这种趋势会持续下去。
2018年统计牛IVP的胚胎数超过了100万个，占总数的68.7%。在43个进行了牛胚胎移植的国家中，29个生产IVP胚胎，其中18个国家的牛胚胎的主要是通过IVEP获得，这些国家生产的IVP胚胎数占全世界的85.7%。相比于IVD胚胎，IVP胚胎的生产和使用情况也因地区而异，北美和南美国家就比欧洲生产和使用得多。
据IETS(Viana 2020)统计，2019年共生产了1419336枚牛胚胎，比2018年减少了5.3%，首次出现比前一年减少的情况。
IVD和IVP的胚胎的数量也有了明显的变化，胚胎总数减少的原因就是IVD胚胎数量显着减少（378769 vs 469967，-17.5%），而IVP胚胎的产量已达到了一个稳定水平（1031567 vs 1029400，+0.2%）；牛IVD和IVP胚胎数量的变化使IVP胚胎的比例增高，2019年牛IVP胚胎数占胚胎总数的72.7%，而2018年为68.7%。重要的是，2016年IVP胚胎的数量就已经超过了通过MOET采集的IVD胚胎；这一趋势表明，胚胎生产已从传统的MOET转向IVEP。所有地区牛IVD的胚胎生产量都在减少，且已成为一种趋势。近年来，牛的IVEP和其他辅助生殖技术也已取得显着的进步，在北美、南美和欧洲，用性控精液进行IVEP并配合基因组检测的方法已得到推广和应用。
据统计，2010年，国内可用胚胎采集总数大约有20000枚，常规冻胚移植总数大约有1500枚；2011年可用胚胎采集总数大约有10000枚，常规冻胚移植总数大约有1800枚(余文莉et al. 2013)。近几年来，国内牛IVEP产业化发展仍比较缓慢。
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1.1.2 牛体外受精技术的研究进展.
1.1.3 牛体外胚胎生产效率的影响因素.
1.2 牛胚胎移植的研究进展
1.2.1 国内 外牛胚胎移植的.况.
1.2.2 牛 体外胚胎移植程序的研究进展.
1.3 目的与意义
试验研究
第二章 不同精子纯化方法对牛体外胚胎生产的影响.
2.1 材料和试剂 .
2.1.1 材料来源
2.1.2 仪器设备
2.1.3 主要溶液 与试剂耗材.
2.2 方法 .
2.2.1 卵母细胞的体外成熟
2.2.2 冻精 的纯化分离
2.2.3 体 外受精.
2.2.4 数 据统计分析
2.3 结果
2.3.1 精 子不同纯化方法处理后精子活力和浓度
2.3.2 精子不同纯化方法处理后体外受精的结果.
2.4 讨论.
2.4.1 不同纯化处理 对冻精指标的影响.
24.2 不同纯化处理冻精对体外受精的影响
2.5 小结 .
第三章 不同同期发情方法对受体牛胚胎移植的影响.
3.1 材料和试剂.
3.1.1 材料来源.
3.1.2 仪器设备
3.1.3 主要药品 与耗材.
3.2 方法.
3.2.1 自然发情牛.
3.2.2 PG+PG 法处理受体牛.
3.2.3 CIDR+PG 法处理受体牛
3.2.4 胚胎移 植前受体检查.
3.2.5 胚胎移 植
3.2.6 受体牛胎检.
3.2.7 数 据统计分析.
3.3 结果
3.3.1 受体牛的发情 分布
3.3.2 受体牛发情后 第7天黄体发育的结果，
3.3.3 受体牛怀孕 30天的声像图
3.3.4 不同同期发情方法处理后受体牛的受胎率
3.3.5 部分体外生产犊牛图片.
3.4 讨论
3.4.1 受体牛不同方法处理后同期发情规律
3.4.2 受体牛不同方法处理对黄体的影响
3.4.3 受体牛黄体直径对受胎率的影响
3.5 小结
全文结论
1在进行IVEP时，相比上浮法，使用Percoll密度梯度离心法处理精子可以提高精子密度和卵母细胞IVF后的受精率、卵裂率，但对囊胚率的影响不大。
2相比较PG+PG法处理和自然发情，CIDR+PG法处理胚胎移植受体牛，受体牛发情率更高、发情时间更为集中且受体牛利用率更高。
3不同同期发情方法处理后受体牛的CLD与受胎率之间无显着差异。
参考文献
