中文摘要
镉（Cd）是一种分布广泛的环境污染物，主要通过受污染的食物、空气或饮水被人和动物吸收并在体内蓄积，对机体肝、肾、睾丸、脾、骨等不同组织器官均有较强的毒性作用。肝脏作为氧化应激最活跃的器官之一，也是镉毒性的重要靶器官。海藻糖（Tr）通过其抗氧化特性而在拮抗氧化应激介导的细胞毒性中发挥作用，但Tr在体内拮抗重金属Cd致毒性的效果及作用机制尚未阐明。因此，本课题拟探讨Tr对Cd致大鼠肝毒性的保护效应及可能的保护机制。
本研究将32只SD大鼠随机分为4组：对照组（Cont组），镉处理组（Cd组），海藻糖保护组（Cd+Tr组），海藻糖单独组（Tr组）。给予各组大鼠对应的处理方式，其中Cd组和Cd+Tr组用Cd Cl2溶液代替饮用水，Cd+Tr组和Tr组每天进行Tr灌胃，其余各组做相应对照处理。8周后，大鼠麻醉处死，采血及肝组织样品进行相应检测。
首先，检测大鼠血清中的生化指标（三种肝功能标志酶：ALT、AST和LDH）和肝脏组织学变化，结果显示Cd显着升高三种血清酶的活性并导致肝脏明显的组织学损伤；Tr显着降低了Cd提升的血清生化参数，并缓解了Cd致肝脏组织学损伤，表明Tr拮抗Cd毒性而发挥保肝效应。其次，为探讨海藻糖的保护机制，本研究通过测定血清中氧化应激的生物标志物水平（MDA、T-AOC、GSH、SOD、GPx和CAT）来检测Tr对Cd致氧化应激的影响，结果表明Tr缓解了Cd所致的机体整体的脂质过氧化水平。第三，鉴于Nrf2信号通路在氧化应激中的调控作用，本研究进一步探讨了Nrf2信号通路在Tr缓解Cd致肝脏氧化损伤中的作用。结果表明，海藻糖显着抑制了Cd激活的Nrf2信号通路并下调了Cd提升的酶性抗氧化蛋白（CAT、GPx、SOD1和SOD2）的表达，这可能由于海藻糖进入机体后通过其抗氧化特性代偿Nrf2通路激活的内源性抗氧化酶来发挥抗氧化作用。第四，采用蛋白免疫印迹技术和免疫组化法检测LC3和SQSTM1/p62蛋白表达水平的变化，探讨Tr对Cd致肝脏自噬抑制的影响，结果表明Tr可缓解Cd所致自噬抑制。最后，通过TUNEL染色检测肝脏细胞凋亡率变化，结合蛋白免疫印迹技术分析凋亡关键蛋白（cleaved-PARP、cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-3）表达水平变化，发现Tr能通过阻断caspase依赖性细胞凋亡途径抑制Cd介导的肝脏细胞凋亡。
综上所述，我们发现镉诱导的氧化应激与Nrf2信号通路的激活密切相关，镉诱导的氧化应激还促进大鼠肝脏自噬抑制和肝细胞凋亡。海藻糖作为一种自噬促进剂，且具有抗氧化效应，可减轻镉诱导的氧化应激和Nrf2途径的激活，从而恢复自噬，抑制细胞凋亡，进而发挥对Cd致肝毒性的保护效应。
关键词： 镉；肝脏；氧化应激；细胞自噬；细胞凋亡；海藻糖。
Abstract
Cadmium (Cd) is a widely distributed environmental contamination. Cd is absorbed by humans or animals via contaminated food, air and water, then accumulated in the body. Cdexerts strong toxic effects on different organs and tissues such as liver, kidney, testis, spleen and bone, et al. As one of the most active organs of oxidative stress, the liver is also the important target organ for cadmium toxicity. Trehalose(Tr) protects against oxidative stress-mediated cytotoxicity through its antioxidant properties. The effect and mechanism of Tr antagonizing the toxicity of heavy metal Cd in vivo has not been elucidated. Thus, this study intend to explore the protective effect of Tr on Cd induced hepatotoxicity in rats and the possible protective mechanism.
In this study, 32 SD rats were randomly divided into 4 groups: control group (Cont group), cadmium treatment group (Cd group), trehalose protection group (Cd+Tr group), andtrehalose group (Tr group). The corresponding treatments were given to each group of rats,Cd Cl2 solution replaced drinking water in Cd group and Cd+Tr groups, Tr solution wasadministered daily in Cd+Tr group and Tr group, and the other groups were treated with corresponding control methods. After 8 weeks, the rats were anesthetized and sacrificed,blood samples and liver tissue samples were taken for corresponding detection.
Firstly, serum biochemical indicators (three liver function marker enzymes: ALT, AST,and LDH) and liver histological changes were tested in the test rats. The results showed that Cd can significantly increase the activity of three serum enzymes and cause obvious histological damage to the liver. Tr significantly reduced the Cd-elevated serum biochemical parameters , and alleviated the Cd-induced liver histological damage, indicating that Tr antagonizes the toxicity of Cd and exerts the liver-protecting effect. Secondly, in order to investigate the protective mechanism of trehalose, this study measured the biomarker level of oxidative stress in serum (MDA, T-AOC, GSH, SOD, GPx and CAT) to examing the effect of Tr on Cd-induced oxidative stress. The results indicate that Tr alleviates Cd-induced whole body lipid peroxidation. Thirdly, in view of the regulatory role of Nrf2 signaling pathway in oxidative stress, this study further explored the role of Nrf2 signaling pathway in Tr mitigate Cd-induced hepatic oxidative damage. The results showed that trehalose significantly inhibited the Cd-activated Nrf2 signaling pathway and down-regulated the expression of Cd-enhanced enzymatic antioxidant proteins (CAT, GPx, SOD1 and SOD2), which may be due to when trehalose enters the body through itself antioxidant properties replace Nrf2-activated endogenous antioxidant enzymes to exert antioxidant effects. Fourthly, the expression of LC3 and SQSTM1/p62 protein was detected by Western blotting and immunohistochemistry to investigate the effect of Tr on the Cd-induced autophagy inhibition.The results showed that Tr can alleviate the inhibition of autophagy induced by Cd. Finally,the apoptosis rate of liver cells was detected by TUNEL staining and the expression levels of cleaved-PARP, cleaved-caspase-9 and cleaved-caspase-3 were analyzed by Western blotting. We found that Tr inhibits Cd-mediated hepatic cell apoptosis by blocking caspase-dependent apoptosis pathway.
In summary, we found that cadmium-induced oxidative stress is closely related to the activation of Nrf2 signaling pathway. Cadmium-induced oxidative stress also promotes autophagy inhibition and hepatocyte apoptosis in rats. As an autophagy promoter, trehalose also has an antioxidant effect, which can alleviate cadmium-induced oxidative stress and activation of the Nrf2 pathway, thereby restoring autophagy and inhibiting apoptosis to exerting the protective effect on Cd-induced hepatotoxicity.
Key words: cadmium; liver; oxidative stress; autophagy; apoptosis; trehalose。
1.前言。
1.1、镉的污染概况。
镉(cadmium Cd)是一种延展性良好，具有银白色金属光泽的重金属。随着Cd在工业和农业生产中的广泛应用，Cd致的污染也日益严重（Liu et al., 2016）。环境中的Cd主要通过以下方式进入人体：职业性镉暴露主要来自有色金属冶炼吸入含镉废气，非职业性镉暴露主要来自于香烟，食物链和水（赵伟 等，2005）。Cd的半衰期有10至25年之久，一旦进入机体，就会长时间蓄积并且持续发挥其毒性作用，引起机体肝脏、肾脏、骨骼、脑等多器官的损害，对生殖系统和免疫系统也具有严重毒性作用（李光先 等，2015；Chen et al., 2018）。
据统计，目前人类年均镉排放量约为100万吨，足以导致环境Cd污染，严重威胁人和动物健康。20世纪30年代日本的“痛痛病”是由于神通川河上游的神冈矿山排放废水镉含量严重超标所致污染了下游水及水稻，从而造成了镉中毒（刘莉莉 等，2016）。有统计表明，我国有1/6的耕地（超过2000万公顷）受重金属污染，在华东6个地区随机采购检测大米样品，有大约10%镉超标。2012年1月，广西龙江镉污染事件直接危及下游群众饮水安全。引起广泛关注，Cd污染威胁到人类的生活和健康，因此Cd污染问题已经步入公众视野，成为当前研究的热点问题。
1.2、镉的毒性研究。
1.2.1、镉的代谢。
镉是一种对人体具有毒副作用的重金属，过量镉摄入会对机体产生许多负面影响，如癌变和细胞凋亡等。镉主要通过呼吸道、消化道或者皮肤被机体吸收，消化道中的镉吸收率为5%~10%，呼吸道中的镉吸收率为10%~40%（皮会丰，2015）。被机体吸收入血的镉，结合含琉基的白蛋白为主的血浆蛋白，随血液运输至机体各组织器官。肾脏与肝脏是镉主要的靶器官，40~60岁正常人类体内镉总量约30 mg，肾脏和肝脏中镉含量分别占机体总量的15%以上，其余广泛分布于脑、胰、睾丸等器官（李会英，2011；Li et al., 2010；Shao et al., 2014）。镉主要通过尿液排泄，少量通过胆汁途径排泄。镉被机体吸收进入血循环后，可诱导肝脏合成金属硫蛋白，并与镉结合后形成镉-金属硫蛋白复合物(Cd-MT)，Cd-MT可经血液运转到肾脏（李慧 等，2015）。
1.2.2、镉对机体的毒性作用。
镉在体内蓄积时间以及生物半衰期长，使其成为已知生物体内最易蓄积的重金属（陈忠翔，2014）。急性或慢性镉中毒均会导致机体组织损伤，并且能损伤包括肝脏、肾脏、骨骼、脑在内的多个器官。如仅摄入少量镉，也可使人出现乏力，头痛，胃痛，甚至全身性骨骼疼痛，骨质疏松等症状，摄入高浓度镉会导致机体死亡（黎晓峰，2007）。已证实Cd所诱导的氧化损伤反应是其生物体毒性的主要原因，Cd通过刺激机体产生过量ROS、导致脂质过氧化发挥其对机体的生物毒性（牟素华 等，2003）。Cd可以通过其诱导的氧化应激，加速机体衰老，诱导肿瘤发生，造成多器官损伤（钱燕 等，2017）。研究发现Cd还可以损伤DNA，主要包括：直接损伤DNA和损伤DNA修复（董峰 等，2018）。目前关于Cd诱导的生殖系统毒性研究表明：镉中毒可以干扰内分泌，进而损伤哺乳动物生殖系统；镉中毒可以损伤啮齿类动物和哺乳动物的性腺组织；而且，摄入大量镉可以导致雄鼠急性持续性睾丸损伤（张凌燕，2018）。此外，镉被证实通过多种途径诱导生物体的细胞凋亡，有体外研究表明低剂量镉可以导致雌性机体生殖细胞凋亡（李雪霞 等，2018）。
1.2.3、镉的肝毒性机制。
肝脏作为机体重要的解毒器官，同时也是镉蓄积的主要靶器官（Babaet al., 2013）。通过许多体内外研究已经证实镉的肝毒性作用，镉对禽类动物肝脏，肾脏均具有明显毒性作用（孙昊宇，2015；Dai et al., 2018）。镉毒性还可以引起多种慢性肝脏损伤：镉可以损伤鸡肝脏组织，导致鸡肝细胞核膜分离，线粒体峭断裂，以及严重的肝细胞凋亡；急性镉中毒还可以引起小鼠肝脏多种病理损伤，包括肝脏细胞肿胀，炎性细胞浸润和肝细胞死亡（范婷婷 等，2017）。
关于镉致肝中毒机制，有研究表明Cd可改变细胞膜通透性，使其它有害物质更易进入细胞进而引起细胞毒性损伤（吴晓刚 等，2006）。还有研究证明，Cd可破坏鸡肝细胞钙稳态，肝细胞中GRP 94，Bax，Caspase-3转录水平升高，由此表明镉可以通过内质网应激进而诱导肝细胞凋亡（邵成成，2012）。镉可以介导大鼠肝细胞氧化应激，刺激肝细胞产生大量超氧阴离子、过氧化氢和自由基等活性氧物质，从而导致氧化和抗氧化失衡，最终导致肝脏细胞凋亡。镉因其非氧化还原特性，可结合GSH，进而减少GSH含量，导致ROS清除障碍，加剧脂质过氧化进而诱导细胞DNA损伤（邓思平 等，2012）。镉可以拮抗机体锌、硒、铜和钙等必需金属元素，进而干扰细胞膜运输和能量代谢等多种细胞代谢过程（李宁，2008）。
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1.3、氧化应激的概述
1.3.1、 镉与氧化应激
1.3.2 、Nrf2/Keap-1通路的简述
1.4、 细胞自噬的概述
1 4.1、自噬水平的检测
1.4.2、 细胞自噬与氧化应激
1.5、细胞凋亡的概述
1.5.1 、细胞凋亡的检测方法
1.5.2、 细胞凋亡与氧化应激.
1.6、海藻糖的性质及应用
1.7、 研究目的与意义
2. 材料与方法
2.1、实验材料
2.1.1、实验动物
2.1.2、试验设计
2.1.3、 样品采集
2.2、主要试剂
2.3、主要仪.器
2.4、相关实验试剂的配制
2.4.1、氯化镉配制方法
2.4.2、海藻糖溶液配制方法
2.4.3、组织固定液配置方法
2.4 4、 Western Blot电泳缓冲液配制方法
2.4.5、WesternBIot转膜缓冲液配制方法.
2.4.6、TBS溶液配制方法
2.4.7、 1X TBST工作液配制方法
2 4.8 、30%丙烯酰胺配制方法.
2.4.9 、10% SDS配制方法.
2.4.10、 10%过硫酸铵(APs)配制方法
2.4.11、 5%脱脂奶粉封闭液配制方法
2.5、试验方法
2.5.1、血清生化指标的测定
2.5.2、组织切片的制备
2.5.3 、HE染色方法
3.5.4、免疫组化
3.5.5 、TUNEL染色
2.5.6 、Western Blot样品制备、电泳及显影
2.5.7、统计学分析
3、结果及分
3.1、海藻糖对镉致肝损伤的保护效应
3.1.1、血清中肝损伤标志酶活性的变化
3.1.2、肝脏组织学变化.
3.2、海藻糖对镉致大鼠氧化应激血清指标的影响
3.2.1、氧化应激终产物MDA水平的变化
3.2.2 、T-AOC水平的变化
3.2.3、三种酶性抗氧化剂活性的变化
3.2.4、非酶性抗氧化剂GSH水平的变化
3.3、海藻糖对Cd所激活NrE信号通路的影响
3.3.1、肝细胞内Nrf2定位的检测
3.3.2 、Nrf2与Keapl蛋白水平变化
3.3.3 、HO-1与NQO1蛋白水平变化
3.4、海藻糖与镉对肝内抗氧化蛋白表达水平的影响
3.5、海藻糖对镉致肝脏自噬抑制的影响
3.5.1、肝组织内p62蛋白水平变化
3.5.2、肝组织内LC3- II蛋白水平变化
3.6、海藻糖对镉介导大鼠肝脏细胞凋亡的影响
3.6.1、大鼠肝脏细胞凋亡率的变化
3.6.2、凋亡标志蛋白水平的变化
4、讨论
1.海藻糖对镉致肝损伤的保护效应
2.氧化应激在Tr对Cd致肝损伤保护中的角色
3.细胞自噬在Tr对Cd致肝损伤保护中的作用
4.细胞凋亡在Tr对Cd致肝损伤保护中的作用
5、结论
（1）海藻糖通过其抗氧化特性缓解镉诱导的肝损伤。
（2）海藻糖作为抗氧化剂替代大鼠肝脏内源性抗氧化防御，减弱大鼠肝脏中镉激活的Nrf2信号通路。
（3）海藻糖能够减轻镉诱导的氧化应激和Nrf2通路激活，恢复自噬和抑制细胞凋亡，进而拮抗镉诱导的肝毒性。
参考文献
