乳腺癌是全球发病率最高的女性恶性肿瘤，早期发现乳腺癌并准确分析其分子生物学特点对预后有重要意义。微小 ＲNA( microＲNA，miＲ) 是一种长度约 18 ～25 个核苷酸、进化上高度保守的非编码单链小 ＲNA，通过与靶标 mＲNA 结合，抑制相关 mＲNA 翻译，诱导相关 mＲNA 降解，使目标蛋白表达水平发生变化。一些 miＲNA 具有类似癌基因或抑癌基因功能，在乳腺癌侵袭、发展中发挥重要作用［1］。miＲ-125a 和 miＲ-206 被认为具有类似抑癌基因的功能，Tavazoie 等［2］发现 miＲ-206 在高转移性乳腺癌细胞株中表达下调，在细胞中上调miＲ-206 的表达，细胞的侵袭、转移能力显着下降。
Scott GK 等［3］发现，miＲ-125a 可通过靶向作用于人类表皮生长因子受体 2( HEＲ-2) 和 HEＲ-3 mＲ-NA 下调 HEＲ-2 和 HEＲ-3 蛋白质表达水平，抑制了乳腺癌细胞的迁移和侵袭。目前 miＲ-125a 和miＲ-206 与乳腺癌患者临床病理特征之间的关系还不明确，它们参与乳腺癌发生发展的具体机制仍然存在争议。因此，本研究通过探索 miＲ-125a 和miＲ-206 在乳腺癌及其癌旁组织的表达情况，分析它们与乳腺癌患者临床病理特征之间的相关性。
1 材料与方法
1. 1 一般资料
收集 2013 年 1 月 1 日 ～2013 年 12 月 1 日手术切除并经病理学证实为浸润性导管癌的女性乳腺癌患者 35 例，42 ～62 岁，中位年龄 51 岁，具有完整的临床病理学资料，行乳腺癌改良根治术或保留乳腺癌根治术，肿瘤直径 1. 6 ～ 4. 5 cm( 平均2. 2 cm) ，术中在无菌条件下留取癌组织以及距离癌边缘≥3 cm 癌旁腺体组织。标本获取后立即用无 ＲNA 酶的 0. 9% NaCl 冲洗，ＲNA 酶抑制剂处理，4 ℃过夜，置 －80 ℃冰箱内保存。患者术前均未接受任何治疗( 新辅助化疗及内分泌治疗) ，组织学分类均参考 NCCN 2013 年指南进行。在取材前，所有患者均签署了知情同意书，本研究得到了伦理委员会批准。
1. 2 方法
1. 2. 1 试剂 Trizol 试剂购自美国 Invitrogen 公司，M-MLV 逆转录酶、ＲNA 酶抑制剂、oligo dT、dNTPs、KOD-plus、SYBＲ Mastermix 等 购 自 日 本Takara 公司，引物由上海生工合成。乳腺癌 HEＲ-2 / neu( 17q12) / TOP 2A ( 17q21 ) / CSP17 多色检测试剂盒购自广州安必平医药科技有限公司。
1. 2. 2 miＲ-125、miＲ-206 检测 将所取得的 50 ～100 mg 新鲜组织，提取总 ＲNA，用 500 ng 总 ＲNA分别以 miＲNA 茎环反转录( reverse trasnscription，ＲT) 引物进行逆转录，反应条件为 10 μL 体系，16 ℃ 30 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s; 以 20 μL 反应体系进行实时定量 PCＲ ( real-time polymerasechain reaction，Ｒeal-time PCＲ) ，相关引物系列见表1。miＲNA 检测反应体系包括 1μL ＲT 产物、1 ×SYBＲ Green I Mastermix、0. 5 Ixmol / L miＲNA 特异前向引物、0. 5 Ixmol/L 通用的反向引物。Ｒeal-timePCＲ 条件为: 95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。PCＲ 产物经 8%聚丙酰胺凝胶电泳分析，记录每个反应管中的 Ｒeal-time PCＲ 荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即 Ct 值。以 U6作为内参，分析 miＲNA 的表达，表 1 为相关引物序列，采用定量 PCＲ 中的相对定量法，以 2－ △△Ct表示肿瘤组织目的基因的表达相对于配对的癌旁组织的倍数变化，其中△△Ct = ( Ct miＲNA － Ct U6) 肿瘤组织 － ( Ct miＲNA － Ct U6) 癌旁组织。
1. 2. 3 雌激素受体和孕激素受体 肿瘤标本经石蜡包埋处理切片 4 μm，采用免疫组化 SP 法，检测雌激素受体( estrogen receptor，EＲ) 和孕激素受体( progesterone receptor，PＲ) 的表达。结果判断: EＲ和 PＲ 蛋白表达以胞质内出现弥漫的棕黄色颗粒为阳性。染色强度评分: 0 分为未着色，1 分为弱染呈淡黄色，2 分为中度染色呈黄色，3 分为强染呈棕黄色，4 分为很强呈褐色。观察高倍视野( 400× ) 计数 100 个细胞中阳性细胞所占百分比，0 分为阴性，1 分为阳性细胞≤25%，2 分为 ＞ 25% ～50% ，3 分为 ＞ 50% ～ 75% ，4 分为 ＞ 75% 。染色强度与阳性细胞的分值相加，0 分为阴性( － ) ，1 ～4分为弱阳性( + ) ，5 ～ 8 分为强阳性( + + ) ，弱阳性也归为阴性表达，强阳性定义为阳性表达。
1. 2. 4 HEＲ-2 和 DNA 拓扑异构酶 2A( TOP 2A)的表达 荧光原位杂交法( FISH) 检测肿瘤标本切片厚 4 μm。显微镜下计数: 在清晰的肿瘤区域，在60 个核内计数位点特异探针 ( GSP ) HEＲ-2 ( 红色) 、GSP TOP 2A( 绿色) 和 CSP17( CSP 指着丝粒探针) ( 青色) 信号，分别记录 GSP HEＲ-2、GSP TOP2A 和 CSP17 的信号总数、GSP HEＲ-2 与 CSP 17 比值及 GSP TOP 2A 与 CSP17 比值。HEＲ-2、TOP 2A结果判定标准: ( 1) GSP HEＲ-2、TOP 2A( 红色、绿色) 分别出现众多信号连接成簇; ( 2) GSP HEＲ-2、TOP 2A / CSP17 ( 红色、绿色 / 青色) 比值分别 ≥2. 2、2; ( 3) GSP HEＲ-2、TOP 2A / CSP17 ( 红色、绿色/青色) 比值分别 ＜ 1. 8、0. 8; ( 4) GSP HEＲ-2、TOP 2A CSP17 ( 红色、绿色 / 青色) 的比值分别为1. 8 ～ 2. 2、0. 8 ～ 2. 0［4］。若满足情况( 1) 或( 2) ，判定为 HEＲ-2、TOP 2A 基因扩增; 若满足情况( 3) ，判定为 HEＲ-2、TOP 2A 基因无扩增; 若满足情况( 4) ，需要再计数 20 个细胞核中的信号，或由另一位实验人员重新计数，如仍为临界值，则应在检测报告中注明，假如在计数区域存在信号弱或高背景情况，有可能干扰到信号判断，应再拿一张组织切片重新进行实验。
1. 3 统计学方法
采用 SPSS 13． 0 统计软件对表达差异进行分析，因本研究样本例数较少，得出数据非正态分布，miＲNA 的表达数据均以中位数和四分位间距［M( IQＲ) ］表示。配对设计资料采用非参数 Wilcoxon符号秩检验，两组之间比较采用 Mann-Whitney U检验，P ＜0. 05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 miＲ-125a、miＲ-206 表达
35 例乳腺癌中，miＲ-125a 的相对表达量为0. 02 ～ 3. 97，其中 28 例( 80% ) miＲ-125a 的相对表达量小于1，7 例( 20%) 大于1，四分位间距为0. 57～ 0. 97，中位数为 0. 79，采用配对样本 Wilcoxon 符号秩检验，癌组织与癌旁组织 miＲ-125a 表达量差异具有统计学意义( P ＜0. 05) 。miＲ-206 的相对表达量范围是 0. 06 ～ 1. 82，35 例乳腺癌中，30 例( 86%) miＲ-206 的相对表达量小于 1，5 例( 14%)大于1，四分位间距为0. 64 ～0. 92，中位数为0. 85，采用配对样本 Wilcoxon 符号秩检验，癌组织与癌旁组织 miＲ-125a 表达量差异具有统计学意义( P＜ 0. 05) 。
2. 2 HEＲ-2、TOP 2A 表达
35 例乳腺癌患者中，HEＲ-2 基因扩增 16 例( 45. 7%) ，表现为多点状红色或成簇红色; Top2A基因扩增 18 例( 51. 4%) ，表现为多点状绿色或成簇绿色。HEＲ-2、TOP 2A 阴性主要表现为 17 号染色体特异信号呈单一青色或缺失。见图 1。
2. 3 miＲ-125a、miＲ-206 与乳腺癌临床病理的关系
miＲ-125a 的高表达与乳腺癌患者的淋巴结阴性、HEＲ-2 阴性及 TOP 2A 阴性患者具有相关性( P＜ 0. 05 ) ，与肿块大小、年龄、月经状态、EＲ 状态、PＲ 状态无关。miＲ-206 的高表达与相对小的肿瘤体积、EＲ 阴性、PＲ 阴性及 HEＲ-2 阴性具有相关性( P ＜0. 05) ，与乳腺癌患者的年龄、月经状态、淋巴结转移情况以及 TOP 2A 的表达程度无关。见表2。
3 讨论
研究已证实 miＲ 的表达变化与多种人类恶性肿瘤的发生及发展相关，但是它们的调控机制复杂，调控目标蛋白多样，因此，miＲ 功能探索仍然是一个较为复杂的难题。成熟 miＲ-125a( hsa-mir-125a) 位于染色体 19q13. 41，包含处于同一前体的2 条 miＲ ( miＲ-125a. 5p 和 miＲ-125a. 3p) ，与线虫的 lin-4 同源。Li 等［5］的研究发现 miＲ-125a 在乳腺癌中可以发生种系突变，并与乳腺癌的发生发展相 关，其 可 能 突 变 的 位 点 包 括 rs10404453、rs12975333 和 rs143525573 三个扩增片段。miＲ-125a 还直接下调 CEＲBB2、ＲNA 结合蛋白、HuＲ、Ｒho 激酶-1、锌指蛋白 KLF13 和神经母细胞瘤相关AＲID3B 等基因的 mＲNA 和蛋白的水平，发挥肿瘤抑制作用［2，6 －9］。
miＲ-206 定位于人染色体 6p12. 2，被认为是骨骼肌和心肌相关的 miＲ，通过下调 DNA 聚合酶的P180 亚基和肌转录因子促进肌肉分化［10］。随后发现 miＲ-206 在多种人类恶性肿瘤中均表达下调，近期的研究发现其与乳腺癌的关系密切，主要通过下调 EＲα 以及 EＲα 共调节蛋白的 mＲNA 和蛋白表达，依赖 EGF/MAPK 途径抑制乳腺癌细胞增殖［11 －12］。miＲ-206 还 直 接 作 用 于 Notch3、cy-clinD2、Cdc42 等 蛋 白，抑 制 癌 细 胞 的 侵 袭、转移［13 －15］，最近 SNP 研究发现 miＲ-206 在 rs6920648位点发生突变，并与乳腺癌发生相关［16］。
在本实验中，乳腺癌患者肿瘤组织中 miＲ-125a 和 miＲ-206 的相对表达量明显低于癌旁组织，结合文献乳腺癌患者血清中 miＲ-125a 和 miＲ-206 浓度亦明显低于健康女性血清中的表达，提示它们有潜力可以作为乳腺癌肿瘤标记物，用于乳腺癌的早期诊断［17］。本研究结果显示，miＲ-125a 与淋巴结转移呈负相关，miＲ-206 与肿块大小呈负相关，提示 miＲ-125a、miＲ-206 可能作为抑癌基因，对乳腺癌的发展起到抑制作用，此结果与之前文献报道一致［5，18］。目前临床上基于乳腺癌的 EＲ、PＲ 及HEＲ-2 表达情况将乳腺癌分为三型( 激素受体阳性型、HEＲ-2 阳性型、三阴性型) ，对评价乳腺癌预后、选择个体化治疗方案有重要的意义。HEＲ-2阳性的乳腺癌恶性程度较高，术后容易复发及转移，赫赛汀靶向治疗是其治疗的重大进展之一。本研究中 miＲ-125a 的高表达与 HEＲ-2 阴性表达具有相关性，提示 miＲ-125a 可能对 HEＲ-2 的表达具有调节作用，miＲ-125a 已被证明可以直接抑制HEＲ-2 和 HEＲ-3 的表达［3］。miＲ-125a 在接受恩替诺特治疗的 HEＲ-2 阳性乳腺癌患者中表达上调，这种表达上调作用是恩替诺特发挥作用的重要机制，所以 miＲ -125a 对于开发新的抗 HEＲ-2 药物和克服赫塞汀耐药有重要意义［19］。TOP 2A 高表达的乳腺癌有更具侵袭性的生物学行为，在蒽环类单药或蒽环类联合化疗中可取得较好疗效。在本研究中，miＲ-125a 在 TOP 2A 阴性患者中的表达水平高于阳性患者，提示 miＲ-125a 可能调节 TOP2A 基因。
三阴性乳腺癌是具有恶性程度高、易复发、易转移、治疗手段少等特点。国内赵晓艾等［20］用miＲs 芯片技术对三阴性乳腺癌 miＲNA 差异表达谱进行研究，筛选获得 17 个相关 miＲ，显着上调的有 miＲ-93、miＲ-328，显着下调的有 miＲ-145、miＲ-20。本研究中，miＲ-206 高表达与乳腺癌的 EＲ 阴性、PＲ 阴性、HEＲ-2 阴性相关，提示 miＲ-206 可能与三阴性乳腺癌存在相关性，Tavazoie 等［2］在体外细胞实验中，将 miＲ-206 导入转移性乳腺癌细胞株，可以有效抑制乳腺癌细胞的侵袭转移，所以miＲ-206 有望成为三阴性乳腺癌治疗的新靶点。
除对三阴性乳腺癌抑制外，miＲ-206 对 EＲ 阳性细胞株也有较高的抑制作用，目前认为 miＲ-206 是乳腺癌从管腔-A 型转化为基地样型的开关，并且可能逆转管腔-A 型转化为基地样型［21］。所以 miＲ-206 对于乳腺癌的治疗有重要意义。
总之，miＲ-125a 和 miＲ-206 有望作为一种新的肿瘤标志物用于乳腺癌的诊断和预后判断，对于HEＲ-2 阳性和三阴性乳腺癌的治疗具有重要意义，但其详细的作用机制以及能否成为真正临床治疗靶向位点，有待于进一步的研究。
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