胃癌前病变(Precancerouslesionsofgastriccarcinoma,PLGC)是一类易发生癌变的胃黏膜病理学变化,在其基础上发生的胃黏膜细胞异型增生是胃癌发生的重要组织学基础。由于胃癌发生发展的隐匿性强,发现后及时手术复发及转移也较为常见,因此防治PLGC已成为胃癌二级预防的重点及难点。
胃癌严重威胁着人类的生存,其发病率及死亡率高居全世界所有恶性肿瘤的第二位。干预胃癌的有效手段之一则是对PLGC进行阻断及逆转。但是西医目前尚无成熟安全的药物或治疗措施,相对而言,中医药则具有更加明显的优势,不仅使患者症状得到改善,而且能从病理上部分逆转PLGC。课题组经过长期有效的临床经验总结,从胃癌前病变“痰气火三邪蕴结”入手,创立消痰养胃方。本文通过检测大鼠胃癌前病变胃黏膜细胞凋亡相关Bcl-2和Bax蛋白的表达,探讨该方对胃癌前病变的影响机制,这将为临床进一步提供实验依据。研究时间2013年3~12月。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级Wistar雄性大鼠,体重140~160g,中国科学院上海试验动物中心提供,实验动物许可证号码:SCXK(沪):2012-0002。
1.2 试剂与仪器
1.2.1 药品与试剂
消痰养胃方组成柴胡9g、制半夏15g、茯苓15g、黄连9g、白花蛇舌草15g、蒲公英30g、桂枝9g、制大黄6g、白芍15g、炙甘草6g。药材由上海雷允上中药饮片厂提供,附检验报告,并经长征医院制剂室制成含生药浓度为6g/ml的水煎膏;N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG):日本东京化成工业株式会社;无水乙醇,上海国药集团化学试剂有限公司(批号20120531);脱氧胆酸钠,上海日初生物科技有限公司(批号20120815);维酶素片:新乡恒久远药业有限公司(批号20120102),研末配成0.1g/ml混悬液;SP染色试剂盒:上海博光生物科技有限公司。
1.2.2 主要仪器
电热恒温水浴箱,型号:HH.W21.Cu600;光学显微镜及显微摄像系统:OLYMPUS公司产品;石蜡切片包埋机:德国LEICARM2135型;高速低温离心机:德国Sigma,3-18K。
1.3 实验方法
1.3.1 分组处理
75只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组及模型组。空白对照组15只,模型组60只。模型组根据2ml/100g体重要求,起始灌胃量为100μg/ml的MNNG溶液,2日1次,灌胃4周后,再予100μg/mlMNNG溶液自由饮用20周,每只大鼠予1ml无水乙醇灌胃3天1次,进食2d后再禁食1d,禁食当日下午予20mmol/L的脱氧胆酸钠溶液饮用。每周三上午夹尾1次,保持大鼠争夺激怒状态,持续10min,连续24周。造模过程中死亡4只。造模结束后,采用随机数字表抽取8只大鼠进行病理确认。模型组再随机分为消痰养胃方组、维酶素组、模型空白组,每组16只。消痰养胃方组及维酶素组分别给予消痰养胃方及维酶素混悬液灌胃,消痰养胃方组将浸膏制为0.1g/ml混悬液灌胃,浓度为10ml/kg,每日1次;维酶素组将维酶素片研磨制成0.1g/ml的混悬液以10ml/kg灌胃,每日1次;用药时间均为6周。
1.3.2 免疫组化法检测胃黏膜细胞
Bax及Bcl-2蛋白表达第30周末将大鼠按0.3ml/100g体重量腹腔注射10%水合氯醛麻醉处死,游离胃部,沿胃大弯切开,取材部位分别为胃大弯、胃小弯、胃窦部、贲门,并制成石蜡切片。脱蜡后予3%H2O2阻断内源性过氧化物酶5min,PBS冲洗3次,每次5min;2次各5min的微波修复,再分别加入1:80和1:100的抗Bax和Bcl-2抗体,4℃过夜,PBS冲洗3次,每次5min。37℃下分别加入生物素标记的二抗及辣根酶标记的链霉卵白素,各10min,PBS冲洗3次,每次5min。DAB显色,脱水透明后封片。
采用常规SP法。每批实验光强度及放大倍数固定,同时设立阴、阳性对照。随机选择10个视野,首先按阳性细胞所占百分比打分:分别为0分、1分、2分、3分、4分,相应所占百分比为<5%、5%~25%、26%~50%、51%~75%、>75%。再按染色强度打分:分别为0分、1分、2分、3分,相应染色强度为无色、淡黄色、棕黄色、棕褐色。最终得分为阳性细胞百分比打分与染色强度打分相乘结果,≥3分为阳性,记录各组分值并计算阳性表达率,算出积分均数。
1.4 统计处理
已死亡大鼠不纳入统计。所用统计软件为SPSS13.0,计量资料表示为均数±标准差(x±s),计量资料多组间比较采用方差分析(ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验,P<0.05有统计学意义。
2 结果
Bax阳性率及积分均数表达:空白对照组>中药治疗组>阳性药物组>模型对照组;Bcl-2阳性表达率及积分均数表达:模型对照组>阳性药物组>中药治疗组>空白对照组,中药治疗组与阳性药物组及模型对照组相比均有统计学意义(P<0.05),阳性药物组与模型对照组相比也有统计学意义(P<0.05)。见表1。
3 讨论
“正常胃黏膜-浅表性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生-胃癌”这一病理演变过程中已为学术界所共识。文献研究证实胃癌前病变的发生与细胞凋亡的关系密切,细胞凋亡紊乱在其发生发展中起到了决定性的作用。因此治疗胃癌前病变的重要方法则是干预胃黏膜细胞凋亡紊乱,恢复增殖与凋亡的动态平衡。
细胞凋亡作为细胞程序性死亡的一种方式,其重要生理作用则是清除衰老和病变细胞,维持细胞的生理稳定和数量的动态平衡,随着病情发展,增殖与凋亡之间的这种稳定关系被打破,出现细胞恶性增殖,而细胞正常凋亡受到抑制。
Bcl-2和Bax在细胞凋亡调控中起到了重要作用。Bcl-2的升高能延长细胞存活时间抑制细胞凋亡;而与Bcl-2具有一定同源性的Bax则能促进细胞凋亡,二者不仅能维持细胞生理和数量上的平衡而且比值能反映细胞凋亡程度。
胃癌前病变可归于胃脘痛、呃逆、痞满等范畴。一般认为,PLGC的病机是本虚标实、虚实相兼。我们结合临床经验,根据PLGC证候特征,认为痰邪是PLGC的病机核心,并认为其演变规律为:各种致病因素侵入人体,使脾胃运化功能失调,津液停聚成痰,痰邪阻滞于胃,导致气滞,同时痰郁化火,从而致使痰、气、火交阻损伤胃络,导致胃黏膜腺体萎缩,肠上皮化生或不典型增生。胃黏膜细胞在各种致病原因诱导下逐渐恶变,造成细胞始终存在代谢异常,这种代谢异常产生的物质可称为“痰邪”,并且将会一直存在于细胞周围,不断污染和损害正常细胞,从而将其“培育”为胃癌细胞。
基于上述认识,我们运用消痰和胃方(由柴胡、制半夏、茯苓、黄连、白花蛇舌草、蒲公英、桂枝、制大黄、白芍、炙甘草组成),获得满意疗效。方中柴胡、制半夏合用苦辛温燥,痰气并治;茯苓、黄连、白花蛇舌草、蒲公英、白芍,健脾祛湿、清热解毒;桂枝与制大黄,通络导滞;炙甘草补中。
本实验采取以化学损伤为主的多因素造模,结果表明消痰养胃方可调节胃癌前病变胃黏膜细胞增殖与凋亡平衡,从而有效干预胃癌前病变,这一过程可能是通过增强Bax阳性率及积分均数表达,抑制Bcl-2阳性率及积分均数表达而实现的。
